烏賊墨多糖對環磷酰胺介導小鼠睪丸氧化應激損傷的干預效應

谷毅鵬 肖為 張云波 樂小炎 劉華忠 羅萍??

(1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江 524088；2.廣東海洋大學農學院，廣東湛江 524088；3.廣東海洋大學生物化學中心，廣東湛江 524088)お

摘要

［目的］ 探討烏賊墨多糖對環磷酰胺致小鼠睪丸氧化應激損傷的保護作用。［方法］ 隨機將70只成年雄性昆明小鼠分成7組：正常組、模型組、治療組1、治療組2、治療組3、治療組4和治療組5，通過對小鼠腹腔注射環磷酰胺進行造模，灌胃烏賊墨多糖作為化療保護劑，檢測小鼠的體重、睪丸和附睪重量、睪丸指數和附睪指數、精子畸形率、睪丸中抗氧化指標，同時觀察睪丸組織結構。［結果］ 烏賊墨多糖能提高小鼠體重和睪丸重量，降低精子畸形率，提高睪丸組織中抗氧化酶SOD和CAT活性，降低MDA含量，修復睪丸病理學損傷。烏賊墨多糖明顯緩解環磷酰胺對睪丸的氧化損傷，其最佳灌胃劑量為80 mg/kg。［結論］ 烏賊墨多糖有可能作為臨床上的化療輔助藥物。

關鍵詞 烏賊墨多糖；環磷酰胺；小鼠；睪丸；抗氧化

中圖分類號 SB917;RB282.77文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2014）19-06275-04

Interventional Effects of Sepia Polysaccharide against Cyclophosphamide瞚nduced Oxidative Stress Injury to Testis of Mice

GU Yi瞤eng, LUO Ping et al

(School of Food Science & Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang，Guangdong524088)

Abstract ［Objective］ The research aimed to discuss the protection effects of sepia polysaccharide on the cyclophosphamide瞚nduced oxidative stress injury to testis of mice. ［Method］ Seventy adult male Kunming mice were randomly divided into seven groups: normal group, model group , treatment groups Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ. Mice in model group were administrated by using intraperitoneal injection. The sepia polysaccharide was used as chemoprotectant for intragastric administration. The body weight, the weight of testis and epididymis, testis index and epididymis index，abnormal sperm rate and antioxidant indices in testis were detected. And the histological structure of testis was observed. ［Result］ Sepia polysaccharide could enhance the body weight and testis weight，reduce the rate of abnormal sperm，increase the activities of SOD and CAT, decrease MDA content and restore the histopathological injury of testis. The best dosage of sepia polysaccharide for intragastric administration was 80 mg/kg. ［Conclusion］ Sepia polysaccharide might be used as the chemotherapy's adjunctive drug in the clinic.

Key words Sepia polysaccharide; Cyclophosphamide; Mice;Testis; Antioxidation

基金項目 國家自然科學基金項目（41306149，31171667）。

作者簡介 谷毅鵬（1987-），男，河南洛陽人，碩士研究生，研究方向：海洋生物活性物質研究。*通訊作者，講師，碩士，從事天然產物與功能食品研究。

收稿日期 20140526

環磷酰胺(Cyclophosphamide，CP)是一類雙功能烷化劑，可有效治療多種惡性腫瘤，也可作為免疫抑制劑，用于器官移植、類風濕性關節炎和全身性紅斑狼癥等疾病的治療，是一種應用非常廣泛的臨床藥物［1-3］。但是，環磷酰胺在抑制腫瘤細胞增殖的同時，也會影響正常細胞的增殖和分化［4］，從而產生較多毒副作用，對生殖系統特別是男性睪丸的毒性損傷就是其中之一。大量研究表明，腹腔注射環磷酰胺可明顯降低小鼠睪丸的生精功能［5］，破壞睪丸組織內氧化-抗氧化系統的平衡，產生大量自由基以及氧化產物，造成睪丸氧化應激損傷［6］。烏賊墨多糖（Squid ink polysaccharide，SIP）提取自海洋活性物質烏賊墨，是一種高效、無毒、廣譜類細胞保護劑，具有抗氧化［7］、抗腫瘤［8］、抗化療［9］、增強免疫［10-11］等生物學活性。近年來，樂小炎等發現烏賊墨多糖對化療藥物環磷酰胺造成的毒性損傷具有較強的緩解能力，其中對環磷酰胺所致的雄性生殖損傷改善作用也非常明顯［12-13］。筆者從烏賊墨多糖緩解環磷酰胺所致小鼠睪丸氧化損傷的角度來研究烏賊墨多糖對環磷酰胺致小鼠睪丸氧化應激損傷的保護作用，為臨床上開發化療的輔助藥物提供一定理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1

實驗動物。

清潔級昆明小鼠70只，雄性，6周齡，購自廣西醫科大學實驗動物中心，合格證編號為0006318，在廣東海洋大學生化中心實驗動物房適應性飼養1周。

1.1.2

主要試劑。烏賊墨多糖由實驗室自制［13-14］。

注射用環磷酰胺（CP），購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；考馬斯亮藍蛋白定量測試盒、總超氧化物歧化酶（T睸OD）測試盒、丙二醛（MDA）測試盒和過氧化氫酶（CAT）測試盒，均購自南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。

1.1.3

主要儀器。HH6型數顯電子恒溫水浴鍋；KDC160HR型高速冷凍離心機；FDU1100型真空冷凍干燥機；UV2800AH型紫外可見分光光度；N1000型旋轉蒸發儀；JY92并蛐統聲波細胞粉碎機；BX51型多功能顯微鏡。

1.2試驗方法

1.2.1

實驗動物處理及體重測定。

取70只雄性昆明小鼠隨機分成5組：對照組（A）、模型組（B）、治療組1（C）、治療組2（D）、治療組3（E）、治療組4（F）和治療組5（G），每組10只。治療組每天灌胃烏賊墨多糖，C、D、E、F和G各組用量分別為25、40 、60 、80 、100 mg/(kg·d)； 對照組和模型組動物按同樣方法每天給予等量生理鹽水；灌胃至第7天，模型組和治療組小鼠需腹腔注射環磷酰胺，劑量為120 mg/kg，對照組腹腔注射等量生理鹽水；各組實驗動物均連續處理14 d，每隔1 d稱1次體重。

1.2.2

生殖器官指數的測定。在末次給藥24 h后，稱量小鼠體重，然后脫頸椎處死，取雙側睪丸和附睪，迅速清除組織周圍脂肪并稱重。按照以下公式計算小鼠睪丸和附睪指數：生殖器官指數（睪丸/附睪）=每只小鼠生殖器官（睪丸/附睪）重量/每只小鼠體重×100%。

1.2.3

精子畸形率的測定。

將含有1 ml 0.9%生理鹽水的離心管置于37 ℃水浴鍋中預熱，取單側附睪縱向剪成3段，放入離心管中輕輕搖動，37 ℃下溫育5~10 min，使精子充分游出，然后吸取此精子懸液10 μl滴于潔凈載玻片一端，均勻推片，待玻片晾干后用甲醇固定5 min以上，再次晾干后用1%伊紅染色1 h，用水輕沖，干燥，在顯微鏡下觀察精子畸┬溫省＊

1.2.4

睪丸組織的病理學檢測。

取睪丸組織，用10%的甲醛溶液固定，梯度乙醇脫水，常規石蠟包埋，5 μm切片，HE染色，在顯微鏡下觀察睪丸組織結構變化。

1.2.5

睪丸抗氧化指標的測定。

取一側睪丸，加生理鹽水，冰上研磨，制成10%組織勻漿，3 000 r/min離心，取上清。按照試劑盒說明書，采用比色法測定睪丸組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性以及丙二醛（MDA）┖量。

1.2.6

數據處理。使用SAS公司開發的JMP7.0軟件對試驗數據進行統計與分析，結果用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 體重變化

從圖1可以看出，在注射環磷酰胺前，各組小鼠體重變化并無顯著差異（玃>0.05），均呈上升趨勢；注射環磷酰胺后，模型組和治療組1、2的小鼠體重總體均處于下降趨勢，治療組3的動物體重先下降，但第11天后開始上升，對照組和治療組4、5體重一直處于上升狀態；各組小鼠體重從13天開始出現明顯差異，第15天模型組同對照組相比體重顯著降低（玃<0.01），與模型組相比，治療組3、4、5小鼠體重均明顯增高，差異極顯著（玃<0.01）。這說明烏賊墨多糖可有效緩解環磷酰胺對雄性小鼠體重的影響，恢復體重的最小灌胃劑量是60 mg/kg。

2.2 生殖器官指標

由表1可知，與對照組相比，模型組小鼠睪丸重量明顯降低，差異顯著（玃<0.05），睪丸指數也有所降低，但差異并不顯著（玃>0.05），附睪重量和附睪指數也均無明顯差異（玃>0.05），表明環磷酰胺對小鼠的睪丸重量有較強抑制作用；與模型組相比，治療組4、5小鼠經SIP灌胃后睪丸指數顯著增高（玃<0.05），而治療組各組附睪重量和附睪指數的也均無明顯變化（玃>0.05）。這說明烏賊墨多糖主

注：不同小寫字母表示差異顯著（玃<0.05）；不同大寫字母表示差異極顯著（玃<0.01）。A.對照組；B.模型組；C.治療組1；D.治療組2；E.治療組3；F.治療組4；G.治療組5。

圖1 各組試驗小鼠體重的變化

要緩解環磷酰胺對雄性小鼠睪丸重量的影響，其最小灌胃劑量為80 mg/kg。

表1 各組小鼠生殖器官指標的變化(玭=10，x±s)

組別 睪丸重量mg 睪丸指數mg/g 附睪重量mg 附睪指數mg/g

對照組 22.23±2.40a 6.63±0.30 55.25±3.42 1.59±0.14

模型組 17.94±2.87b 6.19±0.62 52.67±5.59 1.54±0.15

治療組1 18.21±2.72ab 6.27±0.69 53.78±5.96 1.58±0.13

治療組2 19.49±1.30ab 6.32±0.74 52.10±4.76 1.59±0.17

治療組3 20.03±2.68ab 6.41±0.82 54.70±5.45 1.59±0.20

治療組4 21.94±1.83a 6.58±0.73 52.88±3.75 1.56±0.17

治療組5 21.70±1.59a 6.52±0.78 56.50±6.15 1.59±0.12

注：同列不同小寫字母表示差異顯著（玃<0.05）。

2.3 精子畸形率

由表2可知，模型組小鼠精子畸形率明顯高于對照組（玃<0.01），精子畸形類型主要為頭部畸形，其中無鉤、胖頭及香蕉頭所占比例較高，說明精子在發育過程中頭部更容易受環磷酰胺的毒害，誘發畸變；與模型組相比，治療組2、3精子畸形率明顯降低（玃<0.05），隨著烏賊墨多糖灌胃劑量的增加，治療組4、5精子畸形率大大降低（玃<0.01），緩解環磷酰胺對小鼠精子損傷的最低灌胃劑量為40 mg/kg。

表2各組小鼠精子畸形率的變化(玭=10，x±s)

組別

各類畸形精子數

無鉤 無定形 香蕉頭 胖頭 尾折疊 其他 總計 畸形率%

對照組 88.70 57.98 8.93 16.02 1.56 2.94 176.13 8.81±0.92Bb

模型組 128.62 101.69 16.39 21.96 3.33 4.54 276.54 13.83±2.04Aa

治療組1 102.42 81.78 13.54 19.68 1.01 2.51 220.95 11.05±1.85 ABab

治療組2 96.09 63.55 11.22 16.05 2.14 3.36 192.40 9.62±2.39 Bb

治療組3 112.66 64.26 11.33 20.41 0.96 2.87 212.50 10.62±1.14 ABb

治療組4 80.74 69.37 11.70 15.62 1.57 2.90 181.90 9.09±2.17 Bb

治療組5 87.82 65.44 7.63 15.57 1.18 2.23 179.87 8.99±2.71 Bb

注：各組檢測小鼠精子總數均為2000。同列不同小寫字母表示差異顯著（玃<0.05）；同列不同大寫字母表示差異極顯著（玃<0.01）。

2.4 睪丸形態學觀察結果

從圖2可以看出，正常組（A）小鼠睪丸曲細精管上皮厚，細胞層數多，生精細胞排列緊密且規則，間質稀少，血管豐富；模型組（B）曲細精管明顯變薄，管腔內空洞化，細胞層數減少，內部生精細胞少且排列松散紊亂，間質明顯有較大空隙，血管稀少；治療組1（C）曲細精管厚度有所增加，但管腔內仍有明顯空洞化，間質變小；治療組2（D）曲細精管細胞層數增加，管腔內空洞化明顯減少，但生精細胞數較少，間質空隙少；治療組3（E）曲細精管無空洞化，精管上皮層厚，生精細胞數目較多，間質少；治療組4（F）和治療組5（G）睪丸在光鏡下與正常組基本相同，曲細小管管壁厚，細胞層較寬，生精細胞豐富且排列規則，間質稀少，血管豐富。由此可見，烏賊墨多糖可恢復環磷酰胺對睪丸組織造成的病理損傷，當灌胃劑量大于60 mg/kg時可明顯減少曲細精管空洞化，減少間質，提高生精細胞數目。

注：A.對照組;B.模型組;C.治療組1;D.治療組2;E.治療組3;F.治療組4；G.治療組5。

圖2各組小鼠睪丸組織切片觀察

2.5 抗氧化指標

由表3可知，模型組小鼠注射環磷酰胺后，與對照組相比，睪丸組織中抗氧化酶SOD和CAT活力均顯著降低（玃＜0.01），MDA含量明顯升高（玃＜0.05）；治療組小鼠隨著烏賊墨多糖灌胃劑量的增加，睪丸中SOD和CAT活性不斷增高，而MDA含量不斷降低。其中，與模型組相比，治療組2、3、4、5睪丸中SOD活性均顯著恢復（玃＜0.01）；而CAT活性從治療組3開始明顯恢復（玃＜0.05），治療組5已恢復至正常組水平（玃＜0.01）；治療組4和5小鼠睪丸組織中MDA含量也均明顯降低（玃＜0.05）。這表明烏賊墨多糖可顯著緩解環磷酰胺對小鼠睪丸組織造成的氧化損傷，提高睪丸組織中SOD和CAT活性，降低MDA含量，提高整體抗氧化能力的最佳灌胃劑量為80 mg/kg。

お

表3 各組小鼠睪丸組織中抗氧化指標（玭=10，x±s)

組別 SOD活性U/mg CAT活性U/mg MDA含量nmol/mg

對照組 110.94±12.58Aa 14.75±1.15Aa 3.23±1.30b

模型組 72.64±8.14Bc 11.63±1.15Bb 5.71±2.62a

治療組1 84.84±7.56ABbc 12.77±1.04ABab 4.14±1.17ab

治療組2 95.09±6.77Aab 13.49±0.49ABab 3.64±1.13ab

治療組3 101.67±12.98Aab 14.17±1.96ABa 3.52±1.26ab

治療組4 103.70±7.08Aab 14.08±1.12ABa 3.38±1.06b

治療組5 102.57±10.26Aab 14.46±2.21Aa 3.37±1.06b

注：同列不同小寫字母表示差異顯著（玃<0.05）；同列不同大寫字母表示差異極顯著（玃<0.01）。

3 小結

環磷酰胺是臨床上應用十分廣泛的化療藥物，毒副作用強，會導致生殖不育或遺傳毒害。大量研究表明，環磷酰胺主要作用于細胞快速分裂增殖的組織，而睪丸就是其中的靶器官之一，該藥可對DNA產生烷化作用，從而干擾細胞內的多種生物學功能，致使生精細胞凋亡，睪丸染色體畸變，睪丸萎縮，造成生育能力降低以及子代遺傳性缺陷等［15-17］。該研究結果表明環磷酰胺可導致小鼠的體重減輕，睪丸萎縮，精子大量畸形，曲細精管空洞化，生精細胞數量減少，間質細胞破壞嚴重，睪丸組織中抗氧化酶SOD和CAT活性明顯降低，MDA含量過度積累，造成睪丸組織嚴重氧化損傷。

烏賊墨多糖作為一種較強抗氧化能力的海洋活性物質［18］，能較大范圍內有效弱化化療藥物對機體組織產生的氧化性損傷，如造血系統、生殖系統、腎、肝、肺、腦等［13,19-22］，通過提高這些組織器官的抗氧化能力，從而減弱化療藥物的毒副作用。該研究結果表明烏賊墨多糖可以緩解化療藥物環磷酰胺造成的睪丸氧化損傷，主要表現在以下方面：①提高生精功能，最直接的表現是修復睪丸組織的病理學損傷，防止睪丸萎縮，提高生精細胞數目，降低畸形率；②提高組織抗氧化能力，SOD和CAT是機體內重要的抗氧化酶，而MDA含量反映組織細胞膜質的過氧化程度，烏賊墨多糖可通過提高睪丸中SOD和CAT活性以及降低MDA的含量，有效清除組織內積累的過量自由基，避免睪丸的氧化損傷；③提高機體免疫能力，降低環磷酰胺對免疫系統的抑制作用，從而避免小鼠體重以及睪丸重量的下降，間接發揮保護作用。綜上所述，烏賊墨多糖有效緩解環磷酰胺對睪丸組織氧化損傷的最佳灌胃劑量為80 mg/kg。據此推測，烏賊墨多糖可以作為臨床上的化療輔助藥物，用于病人在化療后的康復治療，同時對擴大藥源以及海洋資源的充分開發和利用均具有重大意義。

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