黃芪多糖提取及對小葉楊幼苗葉綠素含量的影響

邱本軍 董婉瑩 薛羿 葛康康 崔榮 張玉洲 馬玲

（東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱 150040）お

摘要

［目的］研究黃芪多糖最佳提取工藝，及其對小葉楊幼苗葉綠素含量的影響。［方法］運用水煎法提取黃芪多糖，采用固液比、提取溶劑、提取溫度和提取時間4個試驗條件，進行單因素試驗，并利用正交試驗設計對提取工藝進行優化，所得黃芪多糖處理小葉楊幼苗，探究黃芪多糖對其葉綠素含量的影響。［結果］單因素試驗最終獲得最佳提取工藝為以5%醇堿為提取溶劑，固液比為1∶15，提取溫度為60 ℃，提取1.5 h。正交試驗得出優化提取工藝為以5% 醇堿為提取溶劑，固液比為1∶10，提取溫度為60 ℃，提取1.0 h。10 ﹎g/ml的黃芪多糖能夠顯著提高小葉楊葉綠素a和總葉綠素的含量，而0.1 mg/ml黃芪多糖能夠顯著提高小葉楊葉綠素b的含量。

［結論］黃芪多糖能夠提高植物葉綠素含量，進而促進植物的生長發育。

關鍵詞 黃芪多糖；正交試驗；小葉楊；葉綠素含量

中圖分類號 SB567文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2014）19-06281-04

Extraction of Astragalus polysaccharide and Its Impact on The Chlorophyll Content of 玃opulus simonii

QIU Ben瞛un， MA Ling et al

（School of Forestry, Northeast Forestry University,Harbin,Heilongjiang 150040)

Abstract［Objective］ The best extraction process of Astragalus polysaccharide and its impact on chlorophyll content of popalus simonii seedlings were studied. ［Method］ Using boiling method to extract Astragalus polysaccharide by single factor experiments under solid瞝iquid ratio, solvent extraction, extraction temperature and extraction time in four experimental conditions single factor experiments. By orthogonal experimental design to optimize the extraction process.

Astragalus polysaccharide processing 玃opulus simonii 玸aplings, which investigate the effects of astragalus polysaccharides on chlorophyll content of 玃opulus simonii.

［Result］ Ultimately get the best extraction process as follows: 5% alcohol solution of an alkali as extraction solvent, solid-liquid ratio of 1∶15, extraction temperature is 60℃, extraction 1.5 h.To optimize the extraction process was obtained with 5% alcohol solution of an alkali as extraction solvent, solid-liquid ratio of 1∶10, extraction temperature is 60℃, extraction 1 h.The results show that APS 10 mg/ml can significantly increase the content of chlorophyll a and total chlorophyll, and 0.1 mg/ml Astragalus polysaccharides can significantly improve simonies chlorophyll b content.［Conclusion］ Astragalus polysaccharides can improve plant chlorophyll content, thus contributing to the growth and development of plants.

Key wordsAstragalus polysaccharide; Orthogonal experiments; 玃opulus simonii; Chlorophyll content

基金項目 大學生創新訓練項目（201310225088）；黑龍江省科技攻關項目（GA09B2031）。

作者簡介

邱本軍（1989-），男，山東臨沂人，碩士研究生，研究方向：林藥學。*通訊作者,教授，博士生導師，從事植物源農藥方面的研究。

收稿日期 20140604

黃芪（玆adix astragalus）是豆科植物，分為蒙古黃芪和莢膜黃芪。黃芪自古為常用的益氣中藥，其具有益氣補虛、利水消腫、祛瘡生肌等功效。黃芪多糖（Astragalus polysaccharides,APS）為黃芪中最主要的有效成分，包括葡聚糖和雜多糖［1］。自1981年黃芪多糖被分離提取出來后，其研究和作用范圍不斷擴大。為了進一步開發利用該有效成分，許多研究者對黃芪多糖的提取分離、純化及多糖含量測定做了大量研究，期望找到一種經濟、簡便、高效的提取技術。藥理研究表明：黃芪多糖具有增強人體免疫，促進抗體和免疫細胞生成，抗菌、抗病毒和抗腫瘤，抗衰老以及防輻射，雙向調節血糖等作用［2-5］。但是黃芪多糖對植物的生長調節作用尚未報道。筆者運用水煎法提取黃芪多糖。用所得黃芪多糖處理小葉楊幼苗，探究其對葉綠素含量的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料

東北黃芪根，小葉楊幼苗（試驗室種子繁殖）。

1．2研究方法

1.2.1

黃芪多糖最佳提取工藝的研究。

1.2.1.1

單因素試驗設計。根據傳統的水煎法［6］，設置固液比、提取溶劑、溫度和提取時間4個試驗條件進行單因素試驗設計，并確定最佳提取工藝。其中，固液比為

1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25；提取液為水，碳酸鈉，氧化鈣，5%醇堿；水浴溫度為60、70、80、90、100 ℃；水浴時間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h。

1.2.1.2

正交試驗設計。利用正交試驗研究提取黃芪多糖的最佳工藝，設置3個因素，即提取溫度、提取時間、固液比,每個因素3個水平（表1），按照正交表L9（33）進行試驗（表2）。

表1影響黃芪多糖提取率的因素及水平

水平 A：溫度∥℃ B：提取時間∥h C：固液比

1 60 1.0 1∶2 70 1.5 1∶103 80 2.0 1∶15

1.2.1.3

多糖含量測定(硫酸-苯酚法)。①標準曲線的制作。精密稱取10 mg葡萄糖，加蒸餾水定容到100 ml，配成0.1 mg/ml的標準葡萄糖溶液備用。準確量取標準葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 ml分別加入至10 ml帶塞試管中，各試管中補加蒸餾水至2 ml，以蒸餾水作空白對照，各試管分別加入5%苯酚水溶液1 ml，混合均勻后迅速加入5 ml濃硫酸，搖勻，室溫靜置30 min，測定490 nm下各溶液吸光值。以吸光值獳為縱坐標，葡萄糖濃度C為橫坐標繪制標準曲線［7］。②黃芪多糖含量的測定。將提取液稀釋到一定倍數，取2 ml待測液加入10 ml試管中，以下按標準曲線制作方法操作。

1.2.1.4

黃芪多糖提取率。黃芪多糖提取率=［(獵×n×V)/(m×106)］×100%。其中：獵為待測液濃度（μg/ml）；玭為稀釋倍數；玍為提取液總體積（ml）；玬為黃芪根粉質量（g）。

1.2.2

黃芪多糖對小葉楊幼苗葉綠素含量影響的研究。

選取生長狀況良好且一致的盆栽小葉楊幼苗，分別噴灑0.01、0.1、1、10 mg/ml的黃芪多糖溶液，以清水為對照，噴灑均勻，至葉面水滴不下流為止，同時注意遮蓋土壤，以免黃芪多糖噴灑到土壤中對試驗結果造成影響。連續噴灑3 d。將幼苗置于10 ℃條件下培養，分別在噴灑后24、36、48 h測定其葉綠素含量［8］。

2結果與分析

2.1黃芪多糖最佳提取工藝的確定

2.1.1

標準曲線的繪制。以葡萄糖為標準物配制的葡糖糖標準溶液，采用苯酚-硫酸法在490 nm測定其吸光值。對測得數據采用回歸分析法計算葡糖糖標準曲線回歸方程為珁=0.013 9x-0.0901(R2=0.999 7)。由圖1可以看出，在葡萄糖濃度為10～60 μg/ml范圍內，濃度與吸光值呈線性┕叵怠＊

圖1 葡萄糖標準曲線

2.1.2

單因素試驗設計結果。

2.1.2.1

固液比。由圖2可知，在固液比1∶5到1∶10范圍內，多糖的提取率隨固液比的增加而升高，超過1∶10后，提取率無明顯提高。當固液比達到1∶15時，提取率基本不變，因此，料液比為1∶10時，多糖提取率為最佳。

圖2 固液比對黃芪多糖提取率的影響

2.1.2.2

溶劑。比較不同溶劑條件下的提取率，發現以5%醇堿為溶劑的提取率最高，是水提取率的1.14倍；其次是氧化鈣，是水提取率的1.13倍；碳酸鈉提取率是水提取率的1.09倍（圖3）。試驗結果表明：在5%醇堿為溶劑的條件下，黃芪多糖的提取效果最好。

圖3 提取溶劑對黃芪多糖提取率的影響

2.1.2.3

提取溫度。通過比較各個溫度下黃芪多糖提取率，發現多糖提取率在60 ℃時出現峰值，70~100 ℃提取率不斷升高，100 ℃達到最大值，與60 ℃提取率基本一致（圖4）。試驗結果說明黃芪多糖在60 ℃和100 ℃條件下提取效果最好，但是100 ℃條件下有多種物質被同時提取出來，多糖結構有所變化，而且條件較60 ℃更為苛刻，不易操作，所以在60 ℃條件下提取黃芪多糖最佳。

圖4 提取溫度對黃芪多糖提取率的影響

2.1.2.4

提取時間。通過比較不同提取時間多糖提取率的變化，可以發現提取時間在0.5~1.5 h內，多糖提取率隨時間的增加而升高，超過1.5 h，隨提取時間的延長，多糖提取率基本不變，因此，提取時間為1.5 h為最佳。

通過以上單因素試驗結果，可以得出最佳提取工藝為：以5%醇堿為提取溶劑，固液比為1∶15，提取溫度為60 ℃，提取1.5 h，多糖提取率為19.38%。

圖5 提取時間對黃芪多糖提取率的影響

2.1.3

正交試驗設計結果與分析。通過正交試驗結果分析得出，提取濃度、提取時間、固液比3個因子對多糖提取率的影響大小順序為：固液比（C）、提取溫度（A）、提取時間（B）（表2）。3個因素最優水平為A1B1C2，即提取溫度為60 ℃，提取時間為1.0 h，固液比為1∶10，最終多糖提取率為21.42%。

表2提取黃芪多糖正交試驗L9（33）結果

設計序號 A B C 多糖質量∥g 提取率∥%

1 1 1 1 0.839 5 16.674 4

2 1 2 3 0.578 6 11.479 6

3 1 3 2 1.084 1 21.424 0

4 2 1 2 0.703 7 13.870 1

5 2 2 1 0.579 5 11.439 7

6 2 3 3 0.487 9 9.723 7

7 3 1 3 0.836 1 16.652 0

8 3 2 2 0.920 0 18.158 7

9 3 3 1 0.720 0 14.205 5

K1 16.526 15.732 14.106

K2 11.678 13.693 17.818

K3 16.339 15.118 12.618

R 4.848 2.039 5.200

最優水平 1 1 2

2.2 黃芪多糖對小葉楊葉綠素含量影響的研究

黃芪多糖對小葉楊葉綠素a的影響呈波動性變化，并具有最佳濃度。在24 h時，低濃度黃芪多糖對小葉楊葉綠素a含量無明顯影響，但高濃度（10 mg/ml）對其葉綠素a含量有顯著的提高作用（表3）。36 h時，低濃度（0.01 mg/ml）黃芪多糖對小葉楊葉綠素a含量有顯著提高作用，高濃度對葉綠素a的提高無明顯作用。48 h時，除1 mg/ml濃度以外，其他各處理組均對小葉楊葉綠素a含量有顯著的提高作用。因此，黃芪多糖10 mg/ml是增加小葉楊葉綠素a含量的最佳濃度。

黃芪多糖對小葉楊葉綠素b的影響呈波動性變化，并具有最佳濃度。在24 h時，高濃度（10 mg/ml）處理小葉楊時，葉綠素b含量顯著提高。36 h時，除1 mg/ml處理組以外，其他各處理組均對小葉楊葉綠素b含量有顯著的提高作用。48 h時，當黃芪多糖濃度為0.1 mg/ml時，小葉楊葉綠素b含量有顯著提高（表4）。因此，黃芪多糖濃度為0.1 mg/ml時，是增加小葉楊葉綠素b含量的最佳濃度。

表3 葉綠素a含量的變化

mg/g

測定時間∥h處理濃度∥mg/ml

CK 0.01 0.1 1 10

24 2.245±0.024 c 1.688±0.014 b 1.348±0.022 a 2.300±0.015 c 2.507±0.057 d

36 1.705±0.111 b 2.030±0.008 c 1.784±0.014 b 1.436±0.005 a 1.708±0.008 b

48 1.587±0.005 a 1.651±0.024 b 1.717±0.003 c 1.614±0.010 a 1.825±0.022 d

表4葉綠素b含量的變化

〗mg/g

測定時間∥h 處理濃度∥mg/ml

CK 0.01 0.1 1 10

24 0.853±0.027 c 0.663±0.012 b 0.510±0.037 a 0.812±0.018 c 0.968±0.019 d

36 0.577±0.047 a 0.792±0.013 c 0.666±0.007 b 0.568±0.010 a 0.673±0.010 b

48 0.572±0.028 a 0.622±0.025 ab 0.662±0.006 b 0.591±0.002 ab 0.635±0.073 ab

黃芪多糖對小葉楊葉綠素總量的影響呈波動性變化，并具有最佳濃度。在24 h時，使用高濃度（10 mg/ml）黃芪多糖處理小葉楊時，葉綠素總含量顯著提高。36 h時，低濃度（<0.1 mg/ml）黃芪多糖對小葉楊葉綠素總含量有顯著提高。48 h時，除黃芪多糖濃度為1 mg/ml外，各處理組均對小葉楊葉綠素總含量有顯著提高作用，且當黃芪多糖濃度為10 ﹎g/ml時，葉綠素含量提高效果極為顯著（表5）。因此，10 ﹎g/ml的黃芪多糖對小葉楊葉綠素含量的提高作用最好。

表5葉綠素總含量的變化

mg/g

測定時間∥h 處理濃度∥mg/ml

24 3.097±0.046 c 2.351±0.025 b 1.858±0.060 a 3.112±0.033 c 3.475±0.076 d

36 2.281±0.157 b 2.823±0.019 d 2.450±0.021c 2.004±0.014 a 2.381±0.018 bc

48 2.158±0.032 a 2.273±0.047 b 2.379±0.008 c 2.205±0.012 ab 2.460±0.060 d

3 結論與討論

（1）由于黃芪的種類和產地不同，所以同一種方法提取黃芪多糖也可能有不同的提取率。李紅民等［9］用CaO水溶液提取黃芪多糖的粗提物，結果CaO水溶液多糖提取率最高達11.7%，是水提取率（3.6%）的3.25倍。閆巧娟等［10］采用纖維素酶處理，與對照組相比，提取率由24.4%提高至30.3%。田洛等［11］第1次采用醇堿法提取黃芪多糖，最終提取率達到19.15%。金汝城等［12］采用超聲波法對提取條件進行優化，最終多糖平均含量為8.38%。該研究通過對固液比、提取溶劑、提取溫度和提取時間4個試驗條件進行單因素試驗，最終獲得最佳提取工藝為以5%醇堿為提取溶劑，固液比為1∶15，提取溫度為60 ℃，提取1.5 h。利用正交試驗設計對提取工藝進行優化，得出優化提取工藝為以5%醇堿為提取溶劑，固液比為1∶10，提取溫度為60 ℃，提取1.0 h。經單因素試驗得出的最佳提取工藝的多糖提取率為19.38%，而優化提取工藝的提取率為21.42%。

（2）葉綠素是植物光合作用的重要物質，其含量直接影響植物光合作用的能力，進而影響林木的生長和發育。研究表明，多糖類物質能夠提高葉綠素含量，促進植物的生長。師素云等［13］研究發現一定濃度羧甲基殼聚糖能夠提高玉米幼苗體內葉綠素的含量，調節玉米幼苗的生長。張俊風等［14］發現不同濃度的寡聚糖處理檸條種子，均能提高檸條幼苗的葉綠素含量，且存在最佳濃度。袁建平等［15-16］研究發現一定濃度寡聚糖能夠提高玉米和小麥幼苗體內葉綠素含量，促進幼苗的生長。該研究表明，

在短時間內，高濃度黃芪多糖對小葉楊葉綠素a、葉綠素b及葉綠素總含量均有顯著提高作用。低濃度黃芪多糖對小葉楊葉綠素含量無明顯影響。但隨著時間的延長，除了黃芪多糖濃度為1 mg/ml時，其他處理濃度均對小葉楊葉綠素a和葉綠素總含量有顯著提高作用，且對葉綠素含量的提高作用隨黃芪多糖濃度的增加而增大；僅當黃芪多糖濃度為0.1 mg/ml時，小葉楊葉綠素b含量有顯著增加。由此得出，高濃度黃芪多糖能提高小葉楊體內葉綠素的含量。

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