疑有禽白血病病毒混合感染的肉種雞大肝大脾病

秦卓明 仉偉 劉霞 馬秀麗 黃兵 李玉峰 徐懷英

摘 要：山東某父母代肉種雞開產后死淘率突然升高，死亡雞肝臟、脾臟、腺胃等內臟器官腫大，高峰期周產蛋率僅為72%，明顯低于同場區未發病雞群的83%，更顯著低于其標準產蛋率（87%）。利用RT-PCR技術對腫大的臟器分別進行分子病原學診斷，禽網狀內皮增生癥病毒、戊型肝炎病毒和馬立克氏病毒等PCR檢測結果陰性，而ALV pol基因檢測陽性，經測序與GenBank已發表的ALV E亞群毒株的核苷酸同源性高達97.5%～99.5%。血清學檢測證實， ALV-AB亞群在發病前陽性率為8.3%，而發病后的抗體陽性率則攀升為70%。雞群發病后的種蛋蛋清p27抗原檢測ALV陽性率為5.3%。綜上所述，雞群可能混合感染ALV。

關鍵詞：肉種雞；禽白血病；pol基因；混合感染

中圖分類號：S858.31 文獻標識碼：B 文章編號：1673-1085（2014）11-0006-05

禽白血病（Avian leucosis virus，ALV）是由反轉錄病毒科禽白血病/肉瘤病毒群病毒引起的禽類多種腫瘤性疾病的總稱，具有感染率高、發病率低等特點。它即可誘發產生腫瘤，造成雞只的死亡，又可產生非腫瘤綜合癥，導致雞群生長發育不良，影響生產性能[1-3]。禽白血病一般分為兩大類：一類為A、B、C、D和J亞群等外源性病毒，具有致病性；另一類為E亞群，屬內源性病毒，主要以前病毒的形式存在，對雞幾乎不致病，但可以加重ALV其他亞群和其他病原的感染[4，5]。

2011年初至2012年11月以來，山東省十多個父母代肉種雞場發生大肝大脾病。臨床主要表現為：20周齡以后的雞，雞體消瘦、生長發育不良、產蛋下降、死淘率升高，缺乏產蛋高峰等。剖檢可見發病雞肝臟和脾臟腫大、腺胃腫大，個別雞出現卵黃性腹膜炎和腹腔有血凝塊等。康復雞群多數產蛋達不到指標，加之死淘增高，后代雛雞質量差等，經濟損失巨大。現結合一個雞場的實例，進行病原分析，以期找出針對性防控措施。

1 材料和方法

1.1 病料來源和病毒分離 病料來自山東某父母代肉種雞場，所采組織為死淘雞的可疑腫瘤病變組織，主要包括肝臟、脾臟、腺胃等。采集的腫瘤等病變組織，一部分進行病原學分離和分子病原診斷；另一部分，利用10%福爾馬林固定，進行組織病理學檢查。

1.2 病毒分離和鑒定

1.2.1 病毒分離純化 將病變的腫瘤組織用生理鹽水勻漿，反復凍融3次，離心取上清，加雙抗10000U/ml過夜處理。將上述新鮮病料接種已長成單層的DF-1細胞，0.2ml/瓶，37℃孵育2h后棄掉病毒液，加入含1%胎牛血清的DMEM維持液。在37℃繼續培養7～9d后，將細胞反復凍融3次收獲，繼續傳代至2代病毒，-80℃保存。同時，利用IDEXX公司ALV p27抗原檢測試劑盒進行檢測。

1.2.2 分子病原學鑒別診斷 根據ALVpol基因保守序列設計一對特異性引物，正向引物：5' ACTGCTGCCTTGGAACGATG3'；反向引物： 5' AAGCCGCCGCTGTAGACG 3'。將1.2.1中的病變組織處理液提取總RNA，進行RT-PCR反應，擴增產物于1%瓊脂糖凝膠電泳分析。同時，參考已經發表的文獻設計特異性引物如馬立克病毒（MDV）、網狀內皮組織增生癥病毒（REV）、戊型肝炎病毒（HSS）等進行擴增，進行分子鑒別診斷[6-8]。

1.3 雞群的跟蹤檢測

1.3.1 種蛋蛋清p27抗原檢測 收集該發病雞群所產種蛋92枚，用IDEXX公司ALV p27抗原試劑盒進行檢測。

1.3.2 發病雞群發病前后的不同病原抗體變化 采集雞群發病前血清60份和發病后140份，按照IDEXX公司ALV-AB亞型和ALV-J亞型抗體檢測試驗盒操作說明進行檢測。

1.4 ALV plo基因核苷酸序列比較和系統進化 將分離株的pol核苷酸序列與GenBank中已發表的ALV不同亞群序列利用DNAstar Lasergen6.0軟件進行同源性分析，并利用Mega5.0依據核苷酸同源性繪制系統進化樹。

2 結果

2.1 臨床發病概況 山東某父母代肉種雞場，品種為羅斯308。自22周齡開始，死淘率逐漸增高，31周齡達到高峰，最高周死淘率接近1%，隨后，死淘逐漸減少。臨床表現為：肉種雞雞體消瘦、精神萎靡不振，雞冠、肉髯蒼白，食欲減少，產蛋上升緩慢，缺乏產蛋高峰。表1顯示的是飼養在同一場區健康組和發病組24～34周齡生產指標比較。在生產性能方面，發病組群雞最高周產蛋率僅為72%，遠低于該品種標準生產性能的87%，同時也低于同場飼養的未發病健康組雞群（高峰周產蛋率為83%）。

2.2 臨床剖檢特點 死亡雞群通常十分消瘦，雞冠蒼白，伴有拉稀癥狀。剖檢可見肝脾腫大，色澤多樣，質度不等（圖1A和F）；有的肝臟表面有白色結節（圖1D和E）；有的脾臟表面有白色小點（圖1C）；膽囊充盈；腺胃腫大質硬，腺胃乳頭糜爛（圖1B）。卵泡變性，卵泡膜未見出血，少數雞卵巢萎縮；卵黃性腹膜炎多見，腹腔內存在肝破裂血凝塊。健康組盡管也有死淘雞，但大多以卵黃性腹膜炎為主要癥狀，未見內臟器官腫大等病癥。

圖2顯示的是腫瘤在發病組死淘雞中所占的比例。結果發現：在死淘雞的病理剖檢中，發生腫瘤的比例基本維持在40%～60%，平均為49.6%。而健康未發病組卻不存在這種現象。由此推測，腫瘤是雞群死淘率較高和生產性能差的重要原因。

病理組織HE染色后鏡檢發現：從肝臟中可見大量增生的髓細胞瘤細胞，且大量聚集，呈結節灶性分布，主要見于血管周圍，有的呈彌漫性浸潤，細胞核較大，較疏散。脾臟中亦可見淋巴細胞彌散性分布，紅髓血竇。此外，腺胃中的淋巴細胞則呈彌散性分布。

2.3 ALV p27抗原檢測和抗體跟蹤 由表2可知：發病后32周齡雞群的92個種蛋，其ALV p27抗原陽性率為5.4%（5/92）。抗體檢測表明：發病前后ALV-J檢測均為陰性，而ALV-AB抗體陽性率發病前為8.3%（5/60），發病后攀升為70%（98/140），但未分到ALV A/B亞群病毒。

2.4 ALV病原分離 RT-PCR特異性ALV診斷表明，腫瘤樣品可擴增到大小為662bp的目的條帶，ALV檢測結果為陽性（圖3），經測序分析為ALV，命名為SDBD 2012。陽性樣品接種DF1細胞進行病毒分離。從感染SDBD 2012的DF-1細胞中提取前基因組DNA，PCR擴增env基因中的gp85基因，未擴增出目的條帶。

2.5 ALV pol核苷酸同源性比較及其遺傳進化關系分析 SDBD 2012株的pol基因經測序為672bp。與GenBank中已發表的雞的17個不同亞群ALV的參考株核苷酸同源性比較表明，該毒株與YG6100、E-B9等國際較早發現的ALV內源性E亞群代表株的核苷酸同源性高達99.5%，與2env、1/2env等 美國ALV E亞群經典代表株的核苷酸同源性也較高，為99%。而與國內1997-2009年流行的常見J亞群代表株同源性僅為97.5%～98%（詳見圖4）。

根據Mega5.0，繪制系統進化樹（圖5），分析不同毒株之間的遺傳進化關系。結果顯示，該分離株與E亞群代表株親緣關系較近。

3 討論

3.1 病原學和血清學跟蹤調查 對發病雞群所產的種蛋進行檢測，蛋清ALV p27抗原陽性率為5.3%，證實有ALV感染。利用ALV A/B亞群ELISA抗體試劑盒檢測發病前后雞群的抗體，A/B亞群的陽性率由8.3%攀升到70%，從血清學角度證實可能有A/B亞型ALV感染，但未分離病毒。我國白羽肉雞的種源全部來自國外，J亞型ALV十分普遍[9，10]，但在多個流行大肝大脾的肉種雞場，J亞群ALV抗體檢測在發病前后大都為陰性，反應出此次流行的雞大肝大脾病可以完全排除J亞群ALV的混感。

3.2 ALV E亞群感染 本實驗盡管通過RT-PCR技術證實了ALV的存在，系統進化分析證實分離株與E亞群ALV遺傳距離較近。由于未分到ALV病毒，尚不能克隆gp85基因的序列（型決定基因），因此，不能從病原學的角度肯定E亞群ALV的存在。是否存在E亞群ALV的混合感染值得商榷？但已有大量的證據顯示，E亞群ALV的存在肯定會增強A/B亞群的協同感染[2，4]。至于這些基因片段是來自游離的E亞群ALV，還是來自細胞染色體上固有的序列，尚需要更深入的工作。

3.3 戊型肝炎 此次雞群發生的雞大肝大脾病癥在臨床發病、病理剖檢和組織病理學等方面，與戊型肝炎（Hepatitis spleonomegaly synarones， HSS）所導致的病癥十分相似。淋巴樣細胞浸潤是本次雞群發病的主要組織病理學特征，而該特征也是戊型肝炎的特征性病變之一。值得一提的是：上述病理變化與ALV的A/B亞群很難區分，二者均為淋巴細胞瘤，而與J亞群ALV不同，后者主要是骨髓樣細胞瘤。因此，盡管戊型肝炎RT-PCR和病原分離均未成功，但并不排除戊型肝炎混合感染的可能性。

3.4 協同感染 大肝大脾病的發生原因比較復雜，很可能是多因素的疊加或是長期的積累。由于單一因素的感染所致的損失相對較輕，而多因素混合作用則會導致嚴重的后果。本研究對容易產生腫瘤的網狀內皮增生癥、馬立克和戊型肝炎等進行了檢測，RT-PCR均未檢測到病毒核酸。但是，這不等于說在病理剖檢和組織學病變方面可完全排除戊型肝炎等感染的可能性。由于致腫瘤性病病毒分離培養極為困難，耗時長，成本高，因此，綜合目前臨床發病情況和實驗室檢測結果，混合疊加感染的可能性是最大的。

參考文獻：

[1] Saif Y M，Fadly A M，Glison J R，et al. Disease of poultry [M].12 ed.Ames，USA：Iowa State University Press，2008：514-568.

[2] 崔治中.中國雞群病毒性腫瘤病及防控研究[M]. 北京：中國農業出版社，2013.

[3] 崔治中.我國雞群中病毒性腫瘤病的流行動態及其防控措施[J].中國家禽，2010，32（23）：68-70.

[4] Boyce-Jacino M. T.， O'Donoghue K. and Faras A.J.Multiple complex families of endogenous retroviruses are highly conserved in the genus Gallus [J].Journal of Virology，1992， 66 （8）：4919-4929.

[5] 崔治中.我國不同品種雞群中禽白血病的流行情況及誘發腫瘤的多樣性[J].中國家禽，2010，32（19）：40-42.

[6] 張璐，周恩民，崔治中，等.禽戊型肝炎血清學調查與肝脾腫大綜合癥關系的研究[J].中國家禽，2008，30（20）：22-24.

[7] 王鑫，趙鵬，崔治中.我國地方品種雞分離到的一個禽白血病病毒新亞群的鑒定[J].病毒學報， 2012，28（6）：609-614.

[8] 韋平，何秀苗，王桂軍，等.雞腫瘤病快速鑒別診斷試劑盒及其應用研究[J].廣西科學，2005，12（1）：62-67.

[9] 孫淑紅，柴家前，王 波，等. 表現腺胃炎的蛋用型雞J亞群白血病病毒的分離與鑒定[J].畜牧獸醫學報，2010，41（2）：251-254.

[10] SUN SH，CUI ZZ. Epidemiological and pathological studies of subgroup J avian leukosis virus infectious in chinese local“yellow”chicken [J].Avian Pathology，2007，36：221-226.