黑皮冬瓜NBS類抗病基因同源序列克隆與分析

趙芹等

摘 要 以黑皮冬瓜“B98K”種質為試材，根據已克隆的植物NBS類抗病基因保守結構域設計簡并引物，PCR擴增冬瓜基因組DNA，獲得對應區段的DNA片段，回收克隆與測序后，得到19條抗病同源序列（命名為DNB1至DNB19）。利用DNAStar軟件進行序列分析及同源性比對發現，這些抗病同源序列長度在249～252 nt之間，其核苷酸序列同源性在48.4%～98.8%之間，氨基酸序列同源性為23.2%～100.0%，推導氨基酸序列具有P-loop（GGVGKTT）、Kinase-2a（VLDDVW）典型的NBS保守結構域。同源進化分析將其全部歸為nonTIR-NBS-LRR 類，與推導氨基酸序列多重比較結果一致；該序列與其他作物已克隆抗病基因的氨基酸序列同源性在24.7%～99.0%之間。該組序列已登錄Genbank，登錄號為KF776401～KF776419。

關鍵詞 冬瓜；NBS；抗病同源序列；同源克??；序列分析

中圖分類號 S642 文獻標識碼 A

Abstract According to the conserved domains of NBS type disease-resistant genes in most known plants， two degenerate primers were designed and synthesized. Nineteen RGAs named from DNB1 to DNA19 were obtained by PCR amplification of genome DNA from black wax gourd“B98K”variety. Sequences analysis and alignment results indicated that full-length of these RGAs varied from 249nt to 252nt， the deduced amino acids sequences contained typical conserved domains of NBS family， such as P-loop（GGVGKTT）and Kinase-2a（VLDDVW）. The GenBank accession numbers were obtained（from KF776401 to KF776419）. These RGAs showed great homologous differences with the similarity from 48.4% to 98.8% and with genetic divergence from 1.2 to 88.9 in nucleotide sequence level， while the amino acid sequence homology varied from 23.2% to 100.0%. These RGAs were all divided into nonTIR-NBS-LRR group， which was consistent with the multiple-alignment of deduced amino acid sequences. The similarities varied from 24.7% to 99.0% compared with NBS RGAs of other known species.

Key words Ax gourd； NBS； Resistance gene analogs； Homologous clone； Sequence analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.031

冬瓜（Benincasa hispida Cogn.）屬葫蘆科冬瓜屬1年生蔓性植物，原產中國與印度，現廣泛分布于亞洲的熱帶、亞熱帶和溫帶地區。在中國已有2 000多年的栽培歷史，南北地區均有種植，年播種面積達25萬hm2[1]。冬瓜易栽培，產量高，耐貯運，保健藥用價值高[2-3]，是夏秋季節的重要蔬菜之一，也是華南地區北運和出口創匯的重要蔬菜品種，對于調節蔬菜淡季、保證蔬菜周年供應起著非常重要的作用[4]。但冬瓜的各種病害成為制約冬瓜生產的重要因素，其中枯萎病、疫病以及病毒病為冬瓜3大主要病害，南方地區高溫多雨，發病更加嚴重和頻繁，損失異常嚴重[5]。本課題組通過多年種質資源引進、收集和創新，擁有近400份不同抗性冬瓜材料，并通過病原菌復合接種獲得了2份冬瓜多抗優異材料[5]，利用本課題組的資源優勢，開展冬瓜抗病基因挖掘，分離鑒定與冬瓜抗病相關的基因序列，將為冬瓜抗病品種選育提供理論基礎和技術支持。

植物抗病反應是一個復雜過程，抗病基因的分離克隆一直是植物分子生物學研究領域的熱點之一。自1992年從玉米中克隆首個抗病基因——抗圓斑病基因Hml以來，迄今已從各種植物中分離克隆了70多個抗病基因[6]，但大多數是通過圖位克隆與轉座子標簽技術獲得。這些R基因表達產物存在許多高度保守的區域，如核苷酸結合位點（nucleotide binding site， NBS）、富亮氨酸重復（leucine rich repeat， LRR）、絲氨酸-蘇氨酸激酶結構（Ser/Thr-kinase， STK）等[7-9]，以此為基礎，將抗病基因分為8類，其中NBS類在植物基因組中含量最為豐富，因此根據這些抗病基因的保守序列設計引物，PCR擴增同源序列，成為克隆該類抗病基因的有效途徑，目前已在小麥、水稻、大豆和黃瓜等多種作物中廣泛應用[10-13]。本研究以黑皮冬瓜“B98K”為試材，同源擴增NBS類抗病基因序列，為進一步克隆冬瓜的功能性抗病基因及分子標記輔助育種提供研究基礎，也對進一步研究冬瓜R基因的起源和遺傳進化提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 黑皮冬瓜“B98K”種子由廣東省農科院蔬菜研究所保存，2012年8月播種于溫室營養盤內，待幼苗長至2～3片真葉，采集葉片保存于-70 ℃冰箱備用。

1.1.2 主要試劑與儀器 克隆宿主菌大腸桿菌DH5α由本課題組保存；瓊脂糖購自廣州威佳生物技術有限公司；ExTaq DNA聚合酶、dNTPs與pMD 19-T載體試劑盒購自廣州瑞真生物技術有限公司；DNA回收試劑盒、Amp抗生素和DNA Marker均購自廣州鼎國生物技術有限公司；PCR反應在ABI Applied公司GeneAmp system 9700型擴增儀上進行。

1.2 方法

1.2.2 引物設計與合成 參考白菜、芒果及南瓜等[15-17]NBS類抗病基因的保守結構域，設計合成1對簡并引物，由廣州英駿生物技術公司合成，引物序列如下：

NBS-F：GGYATGGGNGGYMTHGGNAARAC （P-loop，GMGGI/LGKTT），

NBS-R：CCANACATCATCMAGSACAA（Kinase2，L/VVLDDVW/D），其中Y=C/T，N=A/G/C/T，R=A/G，M=A/C，S=C/G，H=A/T/C。

1.2.3 PCR擴增與克隆 以提取的冬瓜總DNA為模板進行PCR擴增，反應體系總體積為25 μL，包括：2.5 μL 10×Exbuffer（含MgCl2）、1 U ExTaq DNA聚合酶、0.2 mmol/L dNTPs、0.4 μmol/L引物和50 ng模板DNA。反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環； 72 ℃延伸10 min。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測結果，在GeneGeniusBio Imaging System（Bio-Rad）凝膠成像系統下觀察和拍照。

1.2.4 PCR產物的純化、克隆與測序 PCR產物回收純化后，與pMD 19-T Vector連接，轉化至DH5α感受態細胞內，涂布于固體LB（含Amp，X-gal與IPTG）培養基上，37 ℃倒置培養過夜，挑取白斑，利用M13通用引物進行菌落PCR檢測，取1 mL陽性克隆菌液送往廣州英駿生物技術有限公司測序。

1.2.5 目的片段序列測定及序列同源性分析 利用Bioedit軟件分析RGAs序列范圍，除去兩端載體部分?？寺∑卫肗CBI Blast工具進行同源比對搜索，結合GenBank公布的其他物種NBS-LRR類抗病基因蛋白序列，利用DNAstar軟件進行序列比對，分析各序列長度、G+C含量、變異位點、同源性及遺傳分歧以及系統發育分析。用于參比的已知抗病基因有：煙草N基因（BAD12594）、亞麻M基因（U73916）、番茄Mi-1.1基因（AF039681）、小麥L11基因（AF093641）、番茄I2C-1基因（AF004878）、擬南芥RPS2基因（U14158），其中RPS2、I2C-1和Mi-1.1屬于nonTIR-NBS-LRR類的抗病基因，N、M與L11屬于TIR-NBS-LRR類抗病基因。

2 結果與分析

2.1 RGAs的克隆與鑒定

利用簡并引物NBS-F與NBS-R擴增黑皮冬瓜基因組DNA，擴增得到250 bp左右的明亮特異條帶（圖1），回收克隆至pMD 19-T載體，挑取21個菌落，對PCR鑒定為陽性的克隆進行測序，合并序列一致的克隆，最后得到19個特異片段，命名為DNB1至DNB19。測序結果表明，這些片段序列長度在249～252 nt之間，其中DNB1序列最長為252 nt，DNB19序列為250 nt，其余均為249 nt。NCBI blastx同源比對分析發現，這19條RGAs均具有NBS-ARC保守結構域，與其他作物R基因均有較高同源性。基酸序列推導發現，DNB1至DNB18都具有連續開放閱讀框（ORF），且都包含NBS類R基因特有的氨基酸保守結構域，因此推測這18條RGAs均為冬瓜RGAs。DNB19也具有NBS類R基因的保守結構，也為抗病基因同源序列，但是它在第5位氨基酸殘基處提前終止，不具備連續的ORF。將序列提交至GenBank，獲得登錄號為KF776401-KF776419。利用MegAlign軟件同源比對分析發現，這19條RGAs核苷酸序列同源性在48.4%～98.8%之間，遺傳分歧為1.2～88.9，其中DNB2與DNB19、DNB11與DNB16之間同源性最高且遺傳分歧最低，分別為98.8%與1.2，DNB7與DNB18同源性最低、遺傳分歧最高，分別為48.4%與88.9，由此可見，各序列間同源性變化較大，說明冬瓜RGAs中存在豐富的變異位點（圖2，表1）。

利用MegAlign軟件對18條RGAs的推導氨基酸序列進行比對，發現其氨基酸同源性在23.2%～100.0%之間，遺傳分歧為0.0～211.0，其中DNB6與DNB19以及DNB18與DNB19氨基酸同源性最低均為23.2%，遺傳分歧最高為211.0，DNB4與DNB8、DNB4與DNB12、DNB4與DNB13、DNB18與DNB6、DNB12與DNB8、DNB13與DNB8、DNB17與DNB11、DNB16與DNB11、DNB13與DNB12等9對基因片段氨基酸序列同源性為100.0%，其相對應的遺傳分歧為0.0（表1）。根據構建的核苷酸序列遺傳進化樹分析，19條RGAs分為2組，其中DNB6與DNB18與其他片段遺傳距離最遠，為第一組，其余RGAs為第二組，包括3個亞組，DNB4、DNB13、DNB8、DNB12、DNB11、DNB16與DNB17為第一亞組，DNB3、DNB14、DNB5、DNB9為第二亞組，其它片段組成第3亞組（圖3）。由此看出，冬瓜NBS類RGAs基因在進化時表現出較大的遺傳分歧。

2.2 冬瓜RGAs保守結構域分析

前人研究報道P-loop區域為GMGGI/LGKTT，Kinase-2區域為（L/F）（L/V）VLD（D/N）（V/M）W，Kinase-3區域為GSR（R/V/K）（V/I）L（L/I/V）TTR[18]。18條RGAs序列比對結果表明冬瓜中NBS類RGAs結構域相當保守，也存在典型的P-loop（GMGGI/LGKTT），Kinase-2（L/VVLDDVW）功能域（圖4），然而保守結構域中部分單個氨基酸發生突變，DNB6與DNB18 P-loop功能域GMGGI/LGKTT變為GMGGI/LGKTM，DNB2、DNB7與DNB10的P-loop功能域變為GM GGI/LGKTA；DNB6與DNB18的Kinase-2功能域LLVLDDVW變為VLVLDDVW，但骨架沒有改變（圖4）。氨基酸序列分析表明，本研究獲得的18條序列（DNB1～18）是潛在的候選基因片段。

2.3 冬瓜RGAs氨基酸序列同源性分析

通過NCBI Blastp程序及MegAlign軟件對RGAs與已知物種的抗病同源序列進行同源比對，19條RGAs的氨基酸序列表現出明顯的NB-ARC保守結構域的特征，與其他物種同源性在24.7%～99.0%之間。其中DNB4、DNB12、DNB13、DNB14、DNB17、DNB18 這6個RGAs與絲瓜NBS-LRR抗性蛋白（AFC97118.1）同源性最高，均為99%，DNB10與其同源性最高為95%，而DNB16與其同源性最高為79%；DNB3、DNB5、DNB7、DNB10、DNB15與來源于黃瓜的NBS-p14-24（AAV38978.1）同源性最高，分別為89%、90%、89%、85%與89%，DNB2、DNB5與瓠瓜NBS-LRR抗性蛋白（AEV46102）同源性最高，均為86%；DNB6、DNB19與來源于黃瓜的推測抗性蛋白At4g27190（XP004172809）同源性最高，分別為79%與80%；DNB1與黃瓜推測抗性蛋白RGA2（XP004148115）同源性最高為74%；DNB8與黃瓜推測抗性蛋白RGA3（XP004152292）同源性最高為82%。

將19條冬瓜RGAs與參比R氨基酸序列構建系統進化樹，結果見圖5。由圖5可知，所有RGAs分成2類，L11、M與N與TIR-NBS-LRR聚為一類，另一類包括所有冬瓜RGAs及RPS2、Mi-1.1、I2C-1，歸為nonTIR-NBS-LRR類。這與冬瓜RGAs氨基酸序列多重比對結論一致。

3 討論與結論

目前冬瓜尚未完成全基因組測序，可利用的相關分子標記也較少，因而通過圖位克隆或轉座子標簽技術法獲得R基因難度很大。利用已報道的植物R基因保守結構域，設計特異簡并引物分離RGAs，成為克隆R基因的有效途徑之一。目前尚未有從冬瓜克隆抗病基因的相關報道，本研究根據已克隆的NBS類R基因保守結構域，設計簡并引物，從黑皮冬瓜中分離了19條抗病同源序列，均具有該類基因的保守結構域，其中18條序列具有開放閱讀框，1條序列不能翻譯為完整的氨基酸序列，可能其屬于基因組中的非編碼區域，同時也說明從植物中分離NBS類同源基因具有很大的隨機性；這些序列與已克隆的黃瓜、絲瓜及葫蘆的R基因蛋白有較高的同源性，表明這些序列屬于RGAs序列，其中可能存在功能性的R基因，另外也表明冬瓜與黃瓜、絲瓜及葫蘆作物近緣的親緣關系。

NBS結構域是最重要的抗病基因保守結構域之一，在植物抗病反應中起著重要作用，但具有NBS結構域的基因不一定就是抗病基因[19]，如RAS（rat sarcoma）族蛋白、ATPase延伸因子、G蛋白以及ATP/GTP結合蛋白都含有NBS位點[20-21]。因此除了NBS結構域，還需其他可能與抗病更直接相關的重要結構域如TIR（toll or interluken-1 receptor）、LRR（1eucine rich repeats）或LZ（1eucine zipper）等[22]。因此，本研究分離得到的18條NBS類RGAs，僅作為具有潛在功能的抗病基因片段，分離鑒定真正具有抗病功能的基因還需更深入研究。

NBS類基因是已知R基因家族中最大的一類基因，以基因簇多拷貝形式與其他R基因序列排列在染色體上[23-24]，使得基因內和基因間錯配、重組、重復的頻率大大提高，促進無義基因與新R基因的產生。有研究表明，點突變、重組、不等交換和基因轉變是R基因進化的主要動力[24-26]。目前從20多種植物中分離到了許多RGAs序列都表現出了很高的變異性[27-33]。冬瓜的19條RGAs核苷酸序列相似性在48.4%～98.8%之間，RGAs之間有912個變異位點，195～202 nt附近變異幅度較高，說明冬瓜NBS類基因存在一個較大的基因家族，這些基因可能是來自同一基因的不同拷貝，且基因變異程度較高。前人研究報道，NBS區域內Kinase-2結構域最后一個氨基酸殘基也是區分TIR-NBS- LRR和nonTIR-NBS-LRR類抗病基因的重要特征[17]，TIR-NBS-LRR類抗病基因中Kinase-2基序最后一個殘基都為天冬氨酸（D），而在nonTIR-NBS -LRR類抗病基因中都為色氨酸（W），因此本研究獲得的冬瓜RGAs均為nonTIR-NBS-LRR類抗性基因，同源進化分析發現冬瓜RGAs與已知的nonTIR-NBS-LRR類基因RPS2、Mi-1.1、I2C-1聚為一類，因此兩種分析結果是一致的。冬瓜RGAs保守結構域也存在較多突變，但未影響到整個保守域性質；保守域外的氨基酸序列變異程度較大，序列整體的相似性變化范圍較廣（23.2%～100.0%），與其他物種的相似性也在24.7%～99.0%之間。這些點突變、插入和缺失可能是引起冬瓜RGAs多樣性的原因。上述研究結果為進化趨異假說提供了一些間接證據[34]。

同源克隆分離R類基因也具有自身局限性，如分離基因具有很大的隨機性，獲得片段有的不能翻譯為完整的氨基酸序列，有的含有保守結構域，但與植物的抗性無關。因此可通過用不同堿基組合的簡并引物進行PCR反應，或從不同部位時期cDNA分離RGAs，提高獲得不同R序列機會。本研究以黑皮冬瓜“B98K”為試材，同源擴增NBS類抗病基因序列，為進一步克隆冬瓜的功能性抗病基因以及分子標記輔助選擇育種提供研究基礎，也對進一步研究冬瓜R基因的起源和遺傳進化提供借鑒。

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