荔枝葉片受癭螨為害后脂溶性成分的GC—MS分析

牛心等

摘 要 選取正常荔枝葉片和受荔枝瘤癭螨為害的荔枝葉片為樣品，分別以索氏提取法和超聲波提取法進行萃取，經氣相色譜-質譜法（GC-MS）對不同葉片中的脂溶性成分進行分析和鑒定。結果表明，荔枝瘤癭螨的為害會引起宿主葉片化學成分以及含量的變化，主要表現為抗逆相關成分如γ-谷甾醇等植物甾醇類物質含量的增多，以及與光合作用相關的成分如植物醇等化合物含量的減少。

關鍵詞 荔枝瘤癭螨；索氏提取法；超聲波提取法；GC-MS

中圖分類號 S667.1 文獻標識碼 A

Abstract The secondary metabolites of litchi leaves during the growth of normal and Aceria litchii（Keifer）invasion were extracted by Soxhlet and Ultrasonic methods. Then， the constituents were separated and indentified with GC-MS. The results showed the chemical composition and content of litchi leaves changed after Aceria litchii（Keifer）invasion， mainly reflected in the elevated levels of phytosterol， such as γ-clionasterol， and the reduced levels of phytol， which was involved in plant defense and photosynthesis respectively.

Key words Aceria litchii（Keifer）； Soxhlet extraction； Ultrasonic extraction； GC-MS

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.033

荔枝瘤癭螨[Aceria litchii（Keifer）]又名荔枝毛癭螨或毛蜘蛛，是危害荔枝和龍眼的主要害螨，主要分布于我國南方荔枝龍眼產區以及泰國、印度、美國佛羅里達州及夏威夷、澳大利亞、巴基斯坦等國家和地區[1-2]。荔枝瘤癭螨主要危害寄主葉片，也可為害嫩梢和花果。葉片受害后葉面凸起，并從另一面凹陷處長出白色絨毛，絨毛漸變成黃褐色到紅褐色，而且濃密，故稱毛氈病[3]。受害嚴重的葉片完全失去其功能，最后干枯凋落。

蟲癭是由昆蟲等致癭生物誘導寄主植物細胞分裂加速而產生的一種異常組織[4-7]。蟲癭組織為致癭昆蟲提供了生長發育所需的基本食物源[8-9]，也為昆蟲提供了抵御不良外界自然環境的棲身之地[10]。同時保護致癭昆蟲不受天敵的捕食[11]。蟲癭形成過程中，致癭昆蟲會造成周圍部分寄主細胞和組織的異常生長，進而阻礙寄主植物的正常生長，并影響其生理活動，如光合作用等。同時，寄主植物體內次生代謝產物也發生相應變化，以應對其危害，如酚類物質、黃酮類物質含量的增加以及苯丙氨酸解氨酶活性（PAL）的提高等[12-15]。同樣，荔枝瘤癭螨入侵后的寄主葉片上會形成蟲癭，其形成必然會影響荔枝葉片細胞的生理生化代謝。但迄今為止，相關的研究還未見報道。因此，本試驗選取正常荔枝葉片和受荔枝瘤癭螨為害的荔枝葉片為材料，分別采取索氏提取法和超聲波提取法提取樣品，并通過氣相色譜-質譜（GC-MS）對不同葉片中的脂溶性成分進行分析與鑒定，進而對2種材料的相關成分進行初步對比，為荔枝瘤癭螨致畸機理和寄主植物抗病機制的研究提供線索，同時為后續相關實驗提取方法的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 荔枝瘤癭螨采集自海南省儋州市寶島新村荔枝園。荔枝樹苗（品種：妃子笑）購自海南大學園藝園林學院實驗苗圃，先盆栽種植于瓊臺師院溫室大棚2個月，待生長穩定后選取20株生長一致的樹苗進行荔枝瘤癭螨接種，同時取20株作為對照，待55 d荔枝瘤癭螨為害數量最多時分別采集接種葉片和對照組葉片作為試驗材料。試驗材料用蒸餾水洗凈后放 置陰處，待晾干后裝袋并置于-80 ℃冰箱保存。

1.1.2 儀器和試劑 試驗所用主要儀器有HP6890/5975C型氣相色譜-質譜聯用儀（美國安捷倫公司）；KQ-500DB型數控超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；RE-52系列旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；索氏提取器（上海仙象儀器儀表有限公司）。

試劑有乙醇（分析純，上海化學試劑總廠）、氯仿（重蒸工業級，上海化學試劑總廠）、正己烷（分析純，上海化學試劑總廠）。

1.2 方法

1.2.1 索氏提取法 將樣品剪碎放入折疊好的濾紙紙筒內，稱重封口，封口捏出凹面，在圓底燒瓶內加入300 mL的乙醇，放入玻璃球防止爆沸，安裝索氏提取器，加熱保持有液體不斷回流至樣品管內即可，虹吸5次，回收提取液，蒸干濃縮至無醇味，加入150 mL純水溶解蒸干的提取物，倒入錐形瓶內，加入150 mL氯仿，進行混合，靜置15 min，吸出下層溶液，上層溶液再次加入150 mL氯仿進行萃取，共進行3次。將氯仿層和水層分別進行蒸干濃縮，準備質譜分析。

1.2.2 超聲波提取法 取樣品50.0 g剪碎；用正己烷浸提3次，每次超聲波處理30 min；過濾并合并3次正己烷提取液，對提取液進行蒸干濃縮，準備質譜分析。

2 結果與分析

經過GC-MS檢測分析得總離子流圖（圖1～4）及各化學成分相對含量（表1）。

2.1 索氏提取法和超聲波提取法對提取荔枝葉片化合物總量的比較

采用兩種不同的方法，從荔枝受害葉片與正常葉片中共分離鑒定出47種化合物（表1）。其中索氏提取法中對照組提取了20種化合物，處理組提取了21種化合物；超聲波提取法中對照組提取了35種化合物，處理組提取了23種化合物。在索氏提取法中，鑒定出的化合物含量占提取物總量（1 mg）的百分比，分別為對照組72.653%，處理組59.098%。超聲波提取法中，鑒定出的化合物含量占提取物總量（1 mg）的百分比，分別是對照為54.581%，處理為43.386%。

2.2 索氏提取法和超聲波提取法對提取荔枝葉片化合物含量和數量的比較

從分析結果（表1）可以看出，兩種方法提取的成分差異較大，對照組與處理組間也存在較大差異，部分物質含量也發生了變化。兩種方法得到的提取物主要由烴類、醇類、酚類、酸類構成。其中索氏提取中對照組特有的成分有4-[（1E）-3-羥基-1-丙烯基]-2-甲氧基苯酚、角鯊烯、β-生育酚、環鴉片甾烯醇，處理組特有的成分有α-蛇麻烯、杜松腦、亞油酸、硬脂酸、膽甾二烯、β-香樹脂醇乙酸酯。超聲波提取中對照組特有的成分有雙環欖香烯、朱欒倍半萜、表雙環倍半水芹烯、香樹烯、刺伯烯、δ-杜松烯、大根香葉烯B、石竹烯氧化物、異匙葉桉油烯醇、橄欖酸酰胺、三十二烷，處理組特有的成分僅有1-二十六醛。4種樣品中均存在的共性物質有4，6-二甲基-十二烷、異金合歡醇、新植二烯、二十一烷、植物醇、維生素E、β-豆甾醇、γ-谷甾醇。兩種提取方法中4，6-二甲基-十二烷、異金合歡醇、二十一烷、γ-谷甾醇等化合物含量處理組均高于對照組，而植物醇則表現為處理組比對照組相對含量降低。

3 討論與結論

本實驗分別采用索氏提取法和超聲波提取法對兩種樣品的脂溶性成分進行了提取比較，從兩種方法鑒定出的化合物含量占提取物總量的百分比均表現為對照組高于處理組。推斷其可能與荔枝瘤癭螨的為害導致荔枝葉片細胞增生或非正常生長，從而引起葉片成分與含水量發生了變化有關。其次，荔枝瘤癭螨的為害會造成荔枝葉片的局部枯萎，這也可能是對照組高于處理組的一個原因。

綜合兩種提取方法，本試驗獲得了4種生育酚，分別為δ-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚以及維生素E。與對照相比，這4種生育酚的含量除維生素E外，均在侵染后的荔枝葉片中有不同程度的降低。生育酚在自然界是由高等植物的綠葉經過光合作用合成，生育酚含量的降低，從側面反映出，植物光合作用能力的降低[16]。進一步比較發現，對照組相比處理組植物醇含量明顯降低，索氏提取中異植物醇的含量也明顯下降。異植物醇和植物醇均為植物葉綠素組成成分。由此推斷，荔枝瘤癭螨的為害可能影響了寄主植物葉片葉綠素的合成。

倍半萜類物質是一類極為重要的植物次生代謝物質。植食性昆蟲主要依靠嗅覺感受器辨別寄主植物的特異性氣味進而趨向寄主植物。特異性氣味的存在減少了昆蟲在覓食過程中的盲目性[17]。在超聲波提取法中，朱欒倍半萜這種倍半萜類物質的含量出現了對照組高于處理組的現象。朱欒倍半萜常用于昆蟲引誘劑的篩選實驗中。本研究中對照組含量高于處理組的原因可能與害螨逃避天敵昆蟲的一種策略或者與干擾潛在競爭者有關。

所有試驗材料的化合物中均含有β-豆甾醇、γ-谷甾醇等植物甾醇類物質，兩種提取法中γ-谷甾醇的含量處理組相對于對照組均明顯升高。有研究表明[18]在植物細胞膜內的植物甾醇與磷脂相互作用能夠保持膜結構的穩定和調節細胞膜透性。植物甾醇參與植物對外界的脅迫反應，植物甾醇在植物抵抗許多不利因素（生物的和非生物的）的過程中發揮著重要作用[19]。同時，由表1可看出，二十一烷、二十九烷、三十烷等烷烴類物質均有所上升，烷烴類物質是植物表面蠟質層的組成部分，蠟質層是植物防御體系的重要組成部分，在防止病原物侵染、草食性昆蟲及抵御環境脅迫如干旱、紫外線破壞和霜凍中發揮重要作用[20]。荔枝葉片在受到荔枝瘤癭螨為害后，葉片內甾醇類物質以及烷烴類物質含量的升高是否參與了寄主抵御害蟲為害的防御機制還需要進一步的試驗驗證。

參考文獻

[1] 匡海源. 農螨學[M]. 北京： 農業出版社， 1986： 5-7.

[2] 匡海源. 中國經濟昆蟲志（第44冊）， 蜱螨亞綱·癭螨總科（一）[M]. 北京： 科學出版社， 1995： 57.

[3] 胡適連， 李劍書. 荔枝癭螨的初步觀察[J]. 荔枝科技通訊， 1987（1）： 14-17.

[4] 楊集昆. 森林與人類[M].北京： 中國林業出版社， 1985： 22-23.

[5] Stone G N， Schonrogge K. The adaptive significance of insect gall morphology[J]. Ecol Evol， 2003， 18（10）： 512-514.

[6] 賈春楓， 劉志琦. 奇特的蟲癭[J]. 昆蟲知識， 2004， 41（6）： 603-607.

[7] 馬雙敏， 虞 泓， 李晨程， 等. 植物蟲癭[J]. 昆蟲知識， 2008， 45（2）： 330-335.

[8] Hartley S E. The chemical composition of plant galls： are levels of nutrients and secondary compounds controlled by the gall-former[J]. Oecologia， 1998， 113（4）： 492-501.

[9] Morris D C， Schwarz M P， Cooper S J. Phylogenetics of Australian acacia thrips： the evolution of behaviour and ecology[J]. Mol Phylogenet Evol， 2002， 25 （2）： 278-292.

[10] Kurosu U.Host alternation of two tropical gall-forming aphids， Astegopteryx styracophila and A. pallida（Homoptera）[M]. Universidad de León， 1998： 227-234.

[11] Hawkins B A. Predators， parasitoids and pathogens asmortality agents in phatophagous insect populations[J]. Ecology， 1997， 78（7）： 2 145-2 152.

[12] Westphal E， Bronner R. Changes in leaves of susceptible and resistant Solanum dulcamara infested by the gall mite Eriophyes cladophthirus（Acarina， Eriphyoidea）[J]. Can J Botany， 1981， 59： 875-882.

[13] Schultz B B. Insect herbivores as potential causes of mortality and adaptation in gall forming insects[J]. Oecologia， 1992， 90（2）： 297-299.

[14]楊 勇， 陳順立， 吳 暉， 等. 栗癭蜂危害下錐栗葉片中黃酮含量的變化[J]. 福建林學院學報， 2005， 25（2）： 125-127.

[15]吳 暉， 陳順立， 黃紅青， 等. 錐栗抗栗癭蜂性與苯丙氨酸解氨酶活性的關系[J]. 福建林學院學報， 2005， 25（4）： 304-307.

[16] 左大昆譯. 維生素化學[M]. 北京： 中國輕工業出版社， 1959.

[17] 魯玉杰， 張孝義. 信息化合物對昆蟲行為的影響[J]. 昆蟲知識， 2001， 38（4）： 262-266.

[18] Mireille Venken， Han Asard， Jan M C Geuns， et al. Senescence of oat leaves： changes in the free sterol composition and enzyme activities of the plasma membrane[J]. Plant Science， 1991， 79（1）： 3-11.

[19] 張喜春， 韓振海， ХоджайоваЛТ， 等. 植物體內甾醇的合成和生理作用[J]. 植物生理學通訊， 2001， 37（5）： 452-457

[20] 楊愛梅， 吳古飛， 杜 靜， 等.枸杞表皮蠟質層成分及顯微結構的研究[J]. 食品工業科技， 2011， 12（32）： 112-114.