女貞不同種質材料基因組DNA的提取及RAPD引物篩選

趙峰 李碧英 張其文 符偉 張恩華

摘要[目的]提取女貞不同種質材料的基因組DNA，并篩選RAPD引物。[方法]采用改良CTAB法提取女貞基因組DNA，并以此種方法提取的女貞基因組DNA為模板，對RAPD引物進行PCR擴增，篩選有效引物。[結果]篩選出21個多態性豐富、條帶清晰且重復性好的有效引物，經檢測所獲得的基因組DNA條帶清晰，且OD260/OD280在1.8左右。用篩選出的21個有效引物對126份女貞種質材料進行RAPDPCR擴增，均可獲得帶型豐富且清晰可辨的DNA 指紋圖譜。[結論]該方法為快速和準確地應用RAPD方法分析女貞種質材料的遺傳多樣性提供了依據。

關鍵詞女貞（Ligustrum lucidum Ait.）；改良CTAB法；RAPD 標記；引物篩選

中圖分類號Q781文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）01-00024-05

基金項目海南省教育廳基金資助項目（編號：Hjkj201251）。

作者簡介趙峰（1981-），女，山東章丘人，講師，碩士，從事農學研究，Email：928662418@ qq.com。*通訊作者，講師，Email：404281096@qq.com。

收稿日期20131209女貞（Ligustrum lucidum Ait.）是木犀科（Oleaceae）女貞屬（Ligustrum）常綠灌木或小喬木植物，其果實、種子、樹皮、葉和根均可入藥，且毒性較低[1]。女貞苦丁茶作為代茶飲料植物，性味涼、苦后回甘，具有生津止渴、抗腫瘤、護肝、調節免疫系統、延緩衰老、抗炎、降血脂和降血糖等多種保健作用[2-4]。女貞子（FRUCTUS LIGUSTRI LUCIDI）中主要含有三萜類化合物、黃酮類、裂環環烯醚萜類及多糖、氨基酸、脂肪酸、揮發油、色素、礦物質等多種化學成分[5]。

RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增多態性DNA）是由Williams和Welsh在1990年各自獨立發現的一種DNA多態檢測技術[6-7]。該方法具有操作簡單、試驗成本低廉等優點而被廣泛應用于植物種質資源遺傳多樣性的檢測、種質與品種鑒定、種間關系確定和種下劃分等分類學問題的研究[8-15] 。有效提取基因組DNA和尋找適宜的RAPD引物是探討女貞種質資源不同居群間的親緣關系及遺傳多樣性的關鍵因素。筆者提取女貞不同種質材料的基因組DNA，并篩選RAPD引物，以期為快速和準確地應用RAPD方法分析女貞種質材料的遺傳多樣性提供依據。

1材料與方法

1.1材料分別從海南大學苦丁茶種質資源庫所定植的來自不同地域的126份女貞種質材料中，取其嫩芽作為試驗的供試材料；各份種質材料的編號和原產地如表1所示。

材料編號原產地材料編號原產地NZ017貴州省湄潭縣城NZ082湖南省祁東縣步云橋鄉雙江村對塘組NZ018貴州省湄潭縣NZ083湖南省祁東縣步云橋鄉雙江村對塘組NZ019貴州省湄潭縣NZ084湖南省祁東縣步云橋鄉雙江村對塘組NZ020貴州省湄潭縣NZ086湖南省祁東縣步云橋鄉雙江村對塘組NZ021貴州省湄潭縣NZ087湖南省祁東縣步云橋鄉雙江村對塘組NZ022貴州省湄潭縣NZ088湖南省祁東縣步云橋鄉雙江村對塘組NZ023貴州省臺江縣城NZ089湖南省祁東縣步云橋鄉雙江村對塘組NZ024貴州省臺江縣城NZ090湖南省祁東縣步云橋鄉雙江村對塘組NZ025貴州省臺江縣城NZ091湖南省祁東縣步云橋鄉雙江村對塘組NZ026貴州省臺江縣城NZ092湖南省祁東縣步云橋鄉雙江村對塘組NZ028云南省西疇縣法斗鄉NZ093湖南省祁東縣步云橋鄉雙江村對塘組NZ029江西省南昌市NZ094湖南省祁東縣步云橋鄉雙江村對塘組NZ030湖南省祁東縣步云橋鎮雙江村對塘組NZ095湖南省祁東縣步云橋鄉雙江村對塘組NZ031湖南省祁東縣步云橋鎮雙江村對塘組NZ096湖南省祁東縣步云橋鄉雙江村對塘組NZ032湖南省祁東縣步云橋鎮雙江村對塘組NZ097南京農業大學校園NZ033湖南省祁東縣步云橋鎮雙江村對塘組NZ098南京農業大學校園NZ034湖南省祁東縣步云橋鎮雙江村對塘組NZ099南京農業大學校園NZ035湖南省祁東縣步云橋鎮雙江村對塘組NZ100南京農業大學校園NZ036湖南省祁東縣步云橋鎮雙江村對塘組NZ101南京農業大學校園NZ037湖南省祁東縣步云橋鎮雙江村對塘組NZ102南京農業大學校園NZ038湖南省祁東縣步云橋鎮雙江村對塘組NZ104南京農業大學校園NZ039湖南省祁東縣步云橋鎮雙江村對塘組NZ105南京農業大學校園NZ041湖南省祁東縣白鶴鋪鎮排山村站沖組NZ106南京農業大學校園NZ042湖南省祁東縣白鶴鋪鎮排山村站沖組NZ107南京農業大學校園NZ043湖南省祁東縣白鶴鋪鎮排山村站沖組NZ110南京農業大學校園NZ044湖南省祁東縣白鶴鋪鎮排山村站沖組NZ111南京農業大學校園NZ045湖南省祁東縣白鶴鋪鎮排山村站沖組NZ112南京農業大學校園NZ046湖南省祁東縣白鶴鋪鎮高原村高原組NZ113南京農業大學校園NZ047湖南省祁東縣白鶴鋪鎮高原村高原組NZ114南京農業大學校園NZ048湖南省祁東縣白鶴鋪鎮高原村高原組NZ115南京農業大學校園NZ049湖南省祁東縣白鶴鋪鎮高原村高原組NZ116南京農業大學校園NZ050湖南省祁東縣白鶴鋪鎮高原村高原組NZ117南京農業大學校園NZ051湖南省祁東縣白鶴鋪鎮高原村高原組NZ118南京農業大學校園NZ052湖南省祁東縣白鶴鋪鎮高原村高原組NZ119南京農業大學校園NZ053湖南省祁東縣白鶴鋪鎮高原村高原組NZ120南京農業大學校園NZ054湖南省祁東縣白鶴鋪鎮高原村高原組NZ121南京農業大學校園NZ055湖南省祁東縣白鶴鋪鎮高原村高原組NZ122南京農業大學校園NZ056湖南省祁東縣白鶴鋪鎮高原村高原組NZ123四川省巴中市平梁鄉北巖村五組NZ057湖南省祁東縣白鶴鋪鎮高原村高原組NZ124四川省巴中市平梁鄉北巖村五組NZ058湖南省祁東縣白鶴鋪鎮高原村高原組NZ125四川省巴中市平梁鄉北巖村五組NZ059湖南省祁東縣白鶴鋪鎮高原村高原組NZ126四川省巴中市平梁鄉北巖村五組NZ060湖南省祁東縣白鶴鋪鎮高原村高原組NZ127四川省巴中市平梁鄉北巖村五組NZ061湖南省祁東縣白鶴鋪鎮高原村高原組NZ128四川省巴中市平梁鄉北巖村五組NZ062湖南省祁東縣白鶴鋪鎮高原村高原組NZ130四川省巴中市平梁鄉北巖村五組NZ063湖南省祁東縣白鶴鋪鎮高原村高原組NZ131四川省巴中市平梁鄉北巖村五組NZ064湖南省祁東縣白鶴鋪鎮高原村高原組NZ132四川省巴中市平梁鄉北巖村五組NZ065湖南省祁東縣白鶴鋪鎮高原村高原組NZ133四川省巴中市平梁鄉北巖村五組NZ066湖南省祁東縣白鶴鋪鎮高原村高原組NZ134四川省巴中市平梁鄉北巖村五組NZ067湖南省祁東縣白鶴鋪鎮高原村高原組NZ135四川省巴中市平梁鄉北巖村五組NZ068湖南省祁東縣白鶴鋪鎮高原村高原組NZ136四川省巴中市平梁鄉北巖村五組

1.2方法

1.2.1基因組DNA 提取。用改良CTAB法提取基因組DNA[16]，僅降低提取液和琉基乙醇的濃度，即3×CTAB變為2×CTAB，硫基乙醇濃度2.7%。所提取的基因組DNA用紫外分光光度計測定OD值，并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的完整性；最后將樣品釋稀成20 ng/μl，用于RAPD反應體系的引物篩選。

1.2.2RAPD引物篩選。根據所購引物的理論退火溫度，在此理論退火溫度范圍內對75個引物設計2個溫度梯度；即38和39 ℃，在94 ℃預變性4 min，然后按94 ℃變性30 s，退火45 s，72 ℃延伸2 min，進行40個循環，最后72 ℃延伸10 min。

取擴增產物8和2 μl上樣緩沖液（含40%蔗糖和0.25%溴酚藍）混勻，點樣于1.5%瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/ml EB）的上樣孔中，以100 bp的DNA ladder作為對照分子量標準，在0.5×TBE緩沖液中電壓5 V/cm電泳2.0 h，然后在UVP型凝膠成像系統下照相并記錄，檢驗并分析引物篩選結果。

2結果與分析

2.1基因組DNA提取及檢測

2.1.1基因組DNA提取。用改良后的CTAB法提取126份女貞苦丁茶種質材料的基因組DNA，經用紫外分光光度計檢測OD值（見表2）。結果顯示，其OD260/OD280均在1.80左右，經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1～2），DNA片段條帶清晰，無彌散現象。

2.1.2基因組DNA的RAPD擴增結果。試驗結果表明，所設對照中沒有擴增出條帶（圖2中泳道1）；當模板濃度在10～320 ng范圍內，所擴增出的帶型基本一致（圖2中泳道2～8）。另外，用S60號引物對126份種質材料進行RAPD擴增，均能獲得條帶清晰，穩定且豐富的條帶（圖3～4）。由此可見，試驗中所采用的DNA提取方法是切實可行的。

3結論

作者參考李娟玲等的方法和步驟[16]，適當降低CTAB（即用2×CTAB替換3×CTAB）和巰基乙醇的用量（巰基乙醇2.7%），提取女貞不同種質材料的基因組DNA，并篩選RAPD引物，結果表明，女貞總DNA的OD值均在1.7～1.9，濃度在231.8～2 553.1 μg/ml。用這種方法提取的基因組DNA為模板，成功篩選出了21個適合女貞RAPD標記的有效引物，分別用這21個有效引物對126份女貞種質材料擴增，均能擴增出清晰、穩定且豐富的條帶。

綜上所述，用改良的方法提取女貞屬基因組DNA，能有效排除三萜類化合物、黃酮類、裂環環烯醚萜類及多糖等類化合物的干擾。篩選出來的有效引物特異性強，為RAPD標記快速、準確地分析女貞不同居群中種質材料的遺傳多樣性以及各居群種質材料之間的親緣關系，種質材料的分類以及雜交育種等方面的研究提供了分子生物學依據。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2005年版一部）[S].北京：化學工業出版社，2005：31.

[2] 劉國民.中國木犀科代茶植物的多樣性與開發狀況[J].貴州科學，2003，21（1/2）：69-77.