2種不同啟動子驅(qū)動下1—SST基因轉(zhuǎn)化甘蔗的抗旱性比較

武媛麗等

摘 要 將從菊芋中克隆到的蔗糖：蔗糖-1-果糖基轉(zhuǎn)移酶基因（即1-SST基因），與根部特異性表達(dá)啟動子pPST2a組合，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)pPST2a：1-SST基因甘蔗植株，通過分子檢測共得到15個陽性轉(zhuǎn)基因株系。將前期工作得到的轉(zhuǎn)rbcs：1-SST基因甘蔗5個株系與轉(zhuǎn)pPST2a：1-SST基因甘蔗進(jìn)行抗旱性比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)pPST2a：1-SST基因甘蔗的抗旱性高于轉(zhuǎn)rbcs：1-SST基因甘蔗。與啟動子rbcs相比，啟動子pPST2a能夠更大程度上增強(qiáng)轉(zhuǎn)1-SST基因甘蔗植株的抗旱性。

關(guān)鍵詞 果聚糖；1-SST；轉(zhuǎn)基因甘蔗；抗旱性比較

中國分類號 S59；Q812 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Drought Resistance of the Transformed Sugarcanes with

1-SST Gene Driven by Two Different Promoters

WU Yuanli，ZHANG Shuzhen，LI Xiaojun，CAI Wenwei，YANG Benpeng*

Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/

Sugarcane ResearchCenter， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biology

and Genetic Resources of Tropical Crops， Ministry of Agriculture， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract Fructan is a nonreducing polysaccharides of glucose that functions as a protectant in the stabilization of biological structures and enhances the stress tolerance under abiotic stresses in organisms. The sucrose：sucrse 1-fructosyltransferase（1-SST） gene from Jerusalem artichoke combined with root specific promoter pPST2a was transferred into sugarcane（Saccharumofficinarum L.）using Agrobatorium-mediated method. Results indicated that 15 pPST2a：1-SST transgenic lines were successfully obtained according to molecular detection. Compared the drought resistance of the transgenic sugarcane between the one with pPST2a：1-SST lines obtained in the study and the other one with rbcs：1-SST obtained in previous research. The resuults showed that drought resistance of the transgenic sugarcane with pPST2a：1-SST lines was better than the one with rbcs：1-SST. And it revealed that promoter pPST2a could make drought resistance of transgenic sugarcane even stronger than the promoter rbcs.

Key words Fructan；1-SST；Transgenic sugarcane；Comparison of drought resistance

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.001

甘蔗是世界上最為重要的糖料作物，也是理想的可再生能源作物。甘蔗食糖占中國食糖總量的90%以上[1]。干旱是最為常見的非生物脅迫之一，植物對于干旱的敏感性表現(xiàn)在因水分缺失而導(dǎo)致的滲透脅迫。目前，有80%以上的糖料甘蔗種植在缺乏灌溉條件的旱坡地。干旱嚴(yán)重影響糖料甘蔗的產(chǎn)量，已成為影響甘蔗生產(chǎn)范圍最廣、頻率最高、損失最為嚴(yán)重的自然災(zāi)害之一。

植物對于干旱的敏感性之一，即表現(xiàn)在因水分缺失而導(dǎo)致滲透脅迫。植物在長期的進(jìn)化過程中產(chǎn)生多種機(jī)制來適應(yīng)這種逆境脅迫，如積累季胺類（甜菜堿）、氨基酸類（脯氨酸）、糖類（海藻糖、果聚糖、山梨糖醇）等[2-3]滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。國內(nèi)外很多研究證明，將微生物中編碼高聚合度（degree of polymers， DP）果糖的果糖基轉(zhuǎn)移酶基因（SacB基因）轉(zhuǎn)入煙草（Nicotiana tobacum）、番茄（Lycopersicon esculentum）、甜菜（Beta vulgaris）、小麥（Triticum aestivum）后， 植株的耐旱性和耐鹽性[4-8]均得到明顯的提高。而由1-SST基因編碼的蔗糖： 蔗糖-1-果糖基轉(zhuǎn)移酶合成的低聚合度（DP=3）果聚糖對植物抗旱性改良的相關(guān)報(bào)道較少。李慧娟等[9]將1-SST轉(zhuǎn)入模式植物煙草中，使煙草的抗旱性得到了明顯的提高。葉興國等[10]將1-SST基因轉(zhuǎn)入小麥中，發(fā)現(xiàn)在水分脅迫處理前15 d內(nèi)果聚糖積累量較低，水分脅迫21～28 d果聚糖開始積累，隨著復(fù)水后干旱脅迫解除，果聚糖含量下降，低聚果糖的有效積累可提高小麥的抗旱能力。

目前，已獲得的5個轉(zhuǎn)rbcs：1-SST基因甘蔗株系被證實(shí)具有合成低聚果糖的能力并且該植株的抗旱性得到明顯的提高。植物根部在抗旱及耐鹽性上有重要的作用。因此，用根部特異性表達(dá)啟動子pPST2a[11]替換原來的組成型表達(dá)的rbcs啟動子。本研究分析轉(zhuǎn)pPST2a：1-SST基因的甘蔗幼苗的干旱及鹽脅迫影響，并將前期工作得到的轉(zhuǎn)rbcs：1-SST基因甘蔗5個株系與pPST2a：1-SST基因甘蔗進(jìn)行抗旱性比較，以期了解2種不同啟動子作用下，轉(zhuǎn)1-SST基因甘蔗的抗旱性差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 轉(zhuǎn)rbcs：1-SST基因甘蔗株系T0代由本實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)田保存；抗性植株T0代幼苗由本實(shí)驗(yàn)室人工氣候箱中保存。

1.1.2 供試試劑 PCR試劑購自寶生物公司，PCR引物合成及基因測序均由上海生工生物工程公司完成。其它常用的化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 瓊脂糖凝膠電泳儀（北京六一儀器廠），德國Biometra T1 PCR儀，凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD），Eppendorf PCR儀。電導(dǎo)率儀，超凈工作臺，人工氣候箱等儀器設(shè)備均由熱帶生物技術(shù)研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)pPST2a：1-SST基因甘蔗植株的獲得 取抗性植株葉片，用SDS法小量提取其總DNA進(jìn)行1-SST基因的PCR檢測。檢測引物： F1：5′-ACACAAACGGGCTGGACAT-3′，F(xiàn)2：5′-CATTTCC

CTACGCTTACATCCT-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物為1-SST基因中約750 bp片段。程序如下：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5個循環(huán)；94 ℃10 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min，20 ℃保存。其中以含目的基因的重組質(zhì)粒DNA作正對照，以未轉(zhuǎn)化甘蔗的DNA為負(fù)對照，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析并照相。

1.2.2 轉(zhuǎn)pPST2a：1-SST基因的甘蔗幼苗的干旱及鹽脅迫試驗(yàn) 轉(zhuǎn)pPST2a：1-SST基因的甘蔗幼苗模擬干旱及干旱脅迫：將轉(zhuǎn)pPST2a：1-SST基因植株隨機(jī)選出8株和2株未經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化的對照植株分為2組，每一組包括4個轉(zhuǎn)基因植株和1個對照植株。一組培養(yǎng)在同一瓶含15% PEG6000的MS培養(yǎng)基中，模擬干旱脅迫。另一組培養(yǎng)在同一瓶吸足水分的保水劑中，此后不再供水，逐漸形成干旱環(huán)境，分別培養(yǎng)1個月后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

轉(zhuǎn)pPST2a：1-SST基因的甘蔗幼苗鹽脅迫：將轉(zhuǎn)pPST2a：1-SST基因的植株隨機(jī)選出4株和1株未經(jīng)轉(zhuǎn)化的對照植株同時培養(yǎng)在200 mmol/L NaCl的MS培養(yǎng)基中，進(jìn)行耐鹽性測試，培養(yǎng)1個月后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3 轉(zhuǎn)pPST2a：1-SST基因甘蔗與轉(zhuǎn)rbcs：1-SST基因甘蔗抗旱性的比較 分別將2種不同啟動子的轉(zhuǎn)基因甘蔗和未經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化的甘蔗莖稈分別砍成大小相似的帶芽莖段，種植到花盆中，6～7片葉齡后進(jìn)行干旱脅迫，觀察植株的萎蔫情況。取上述轉(zhuǎn)rbcs：1-SST基因的甘蔗株系和轉(zhuǎn)pPST2a：1-SST基因甘蔗株系以及未轉(zhuǎn)化植株作為實(shí)驗(yàn)材料，檢測這些植株的抗旱相關(guān)的生理生化指標(biāo)。取相同部位的葉片進(jìn)行測定，生理生化指標(biāo)包括SOD（超氧化物歧化酶）活性、離體葉片保水率、葉片質(zhì)膜透性（即相對電導(dǎo)率）[12]等。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用Microsoft Office Excel 2003、SPSS13.0等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析（鄧肯法p<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)pPST2a：1-SST基因甘蔗植株的獲得

利用檢測引物F1、F2進(jìn)行轉(zhuǎn)pPST2a：1-SST基因植株的PCR檢測，共獲得15個陽性植株。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)上海生工測序分析，表明擴(kuò)增所得條帶與目的基因片段完全一致。說明目的基因已經(jīng)成功整合到甘蔗基因組中，PCR結(jié)果如圖1。

2.2 轉(zhuǎn)pPST2a：1-SST基因的甘蔗幼苗的干旱及鹽脅迫影響

2.2.1 轉(zhuǎn)pPST2a：1-SST基因的甘蔗幼苗的模擬干旱及干旱脅迫 植物對干旱最主要和最早期的反應(yīng)是缺水，導(dǎo)致葉片萎蔫至干枯，生長受到極大的抑制甚至死亡。

由圖2可知，在模擬干旱實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)基因植株在15% PEG6000的培養(yǎng)基中葉片保持綠色，萎蔫程度較低，生長狀況良好且有不同程度的分蘗，而非轉(zhuǎn)化植株則已枯萎死亡。在干旱實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因植株地上部生長受到的抑制程度較低，葉片伸長較長，根系生長發(fā)達(dá)，而非轉(zhuǎn)化植株的地上部生長相對矮小，根部伸長受到很大的抑制。在模擬干旱及干旱脅迫的條件下，轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)出較強(qiáng)的生存及抗旱能力，轉(zhuǎn)基因植株的地上部及地下部的生長情況好于未經(jīng)轉(zhuǎn)化的植株，尤其是根的發(fā)生和伸長都明顯優(yōu)于對照，說明啟動子pPST2a在根中的特異性啟動表達(dá)能力更有利于植株度過干旱逆境。

2.2.2 轉(zhuǎn)pPST2a：1-SST基因的甘蔗幼苗的鹽脅迫 鹽脅迫直接造成植株生理干旱，植物對鹽脅迫最主要反應(yīng)是干旱和光合器官受損，導(dǎo)致葉片萎蔫至干枯，甚至死亡。

由圖3可知，經(jīng)過1個月的鹽脅迫，轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)不同程度的黃化，根系生長也受到不同程度的抑制，但是總體表現(xiàn)出較好的耐鹽性，而對照植株在鹽脅迫中根系生長幾乎趨于停滯，整個植株已經(jīng)死亡。說明轉(zhuǎn)pPST2a：1-SST基因甘蔗較對照植株有較強(qiáng)的抗鹽性。

2.3 轉(zhuǎn)pPST2a：1-SST基因甘蔗與轉(zhuǎn)rbcs：1-SST基因甘蔗抗旱性的初步比較

2.3.1 干旱脅迫 通過抗旱性比較可以看出，在干旱脅迫下，各株系均出現(xiàn)不同程度的萎蔫，但是相比較之下，未經(jīng)轉(zhuǎn)化的植株由于缺水幾乎完全枯黃，趨于死亡，轉(zhuǎn)rbcs：1-SST基因甘蔗的株系的葉片也出現(xiàn)部分萎蔫和葉黃現(xiàn)象，而轉(zhuǎn)pPST2a：1-SST基因的甘蔗株系只有少量萎蔫，多數(shù)葉片呈現(xiàn)出新鮮綠色（圖4）。轉(zhuǎn)pPST2a：1-SST基因甘蔗的株系在干旱脅迫后的表現(xiàn)最佳，轉(zhuǎn)rbcs：1-SST基因甘蔗株系次之，未經(jīng)轉(zhuǎn)化的甘蔗株系最差。證明根部特異性啟動子pPST2a在根中的特異性表達(dá)更有利于植株度過干旱逆境。

2.3.2 逆境相關(guān)生理生化指標(biāo)結(jié)果 從圖5可知，未受干旱脅迫時，各株系間生理生化指標(biāo)差異不顯著，但經(jīng)過干旱脅迫后，轉(zhuǎn)pPST2a：1-SST基因各株系的SOD酶活性顯著高于轉(zhuǎn)rbcs：1-SST基因各株系，未經(jīng)轉(zhuǎn)化的株系抗氧化物酶活性最低；轉(zhuǎn)基因植株的相對電導(dǎo)率（表示原電導(dǎo)值占總電導(dǎo)值的百分比，其中，樣品材料即葉片與去離子水的混合物，室溫下靜止2 h后測得的電導(dǎo)值為原電導(dǎo)值；煮沸15 min后，溫度降至室溫，在渦旋混合器上震蕩1 min后，測得的電導(dǎo)值為總電導(dǎo)值）均顯著高于未經(jīng)轉(zhuǎn)化的植株，而轉(zhuǎn)pPST2a：1-SST基因植株與轉(zhuǎn)rbcs：1-SST基因植株間差異不顯著；轉(zhuǎn)pPST2a：1-SST基因各株系的離體葉片保水率（自由水占總含水量的百分比）顯著高于轉(zhuǎn)rbcs：1-SST基因的各株系，未經(jīng)轉(zhuǎn)化株系的離體葉片保水率最低。

3 討論與結(jié)論

本研究將參與果聚糖合成的蔗糖：蔗糖-1-果糖基轉(zhuǎn)移酶基因即1-SST基因，與根部特異性表達(dá)啟動子pPST2a組合，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化導(dǎo)入甘蔗中，觀察轉(zhuǎn)基因甘蔗的抗旱性。結(jié)果表明，在干旱脅迫下，未經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化的甘蔗植株的膜脂可能發(fā)生了過氧化作用，加劇活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生和富集，這些有毒害作用的分子破壞了膜結(jié)構(gòu)和生物大分子，并且通過受損傷的膜滲透細(xì)胞內(nèi)溶物質(zhì)，造成質(zhì)膜的通透性增加，進(jìn)而導(dǎo)致了大量的電解質(zhì)外滲[3]。相比之下，轉(zhuǎn)pPST2a：1-SST基因甘蔗植株在一定程度上所受到的傷害較小。果聚糖能維持脂質(zhì)體在溫度變化和干旱條件下相態(tài)的改變，脂類相態(tài)的改變可提高膜的通透性，修復(fù)脅迫對膜的損害[14]。1-SST基因編碼的低聚合度果聚糖的積累與轉(zhuǎn)基因甘蔗抗旱性的提高有關(guān)，這與SacB基因編碼的高聚合度果聚糖通過促進(jìn)根的生長來提高植物抗旱性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致[13-14]。

植物根部在抗旱及耐鹽性上有重要的作用，本研究通過2種不同啟動子驅(qū)動下的轉(zhuǎn)1-SST基因甘蔗的抗旱性比較實(shí)驗(yàn)，證實(shí)在干旱條件下，轉(zhuǎn)pPST2a：1-SST基因各株系與轉(zhuǎn)rbcs：1-SST基因各株系相比，更能減少水的流失，更有效地提高了抗氧化物酶的活性，從而使轉(zhuǎn)pPST2a：1-SST基因甘蔗植株獲得更高的抗旱性；根部特異表達(dá)啟動子pPST2a驅(qū)動下1-SST基因的轉(zhuǎn)化甘蔗的抗旱性及耐鹽性得到進(jìn)一步的提高。說明在缺水條件下，根部特異性表達(dá)啟動子pPST2a驅(qū)動的轉(zhuǎn)1-SST基因甘蔗在干旱逆境脅迫中更能穩(wěn)定的順應(yīng)、度過干旱逆境，同時證實(shí)了該轉(zhuǎn)基因方法在甘蔗新品種培育中具有潛在的應(yīng)用性。

參考文獻(xiàn)

[1] 王勤南， 劉少謀， 金玉峰，等. 甘蔗成熟期不同節(jié)間與全莖稈錘度的相關(guān)性分析[J]. 中國糖料， 2009（1）： 18-20.

[2] Holmberg N， Bülow L. Improving stress tolerance in plants by gene transfer[J]. Trends Plant Sci， 1998， 3（2）： 61-66.

[3] Chen T H H， Murata N. Enhancement of tolerance of abiotic stress by metabolic engineering of betaines and othercompatiblesol

utes[J]. CurrOpin Plant Biol， 2002， 5（3）： 250-257.

[4] Pilon-Smits E A H， Ebskamp M J M， Paul M J， et al. Improved performance of transgenic fructan-accumulating tobacco under drought stress[J]. Plant Physiol， 1995， 107（1）：125-130.

[5] Pilon- Smits E A H， Terry N， Sears T， et al. Enhanced drought resistance in fructan-producing sugar beet[J]. Plant PhysiolBiochem， 1999， 37（4）： 313-317.

[6] 劉偉華， 趙秀振， 梁 虹，等. 枯草桿菌果聚糖蔗糖酶基因轉(zhuǎn)化小麥的研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2006， 39（2）： 231-236.

[7] 張 慧， 董 偉， 周駿馬， 等. 果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及耐鹽轉(zhuǎn)基因煙草的培育[J]. 生物工程學(xué)報(bào)， 1998， 14（2）： 181-186.

[8] 高 峰， 高 強(qiáng)， 岳桂東，等. 小鹽芥（Thellungiella salsuginea）CBF1基因的克隆[J]. 山東大學(xué)學(xué)報(bào)（理學(xué)版）， 2005， 40（5）： 113-118.

[9] 李慧娟， 尹海英， 張學(xué)成，等. 轉(zhuǎn)蔗糖：蔗糖-1-果糖基轉(zhuǎn)移酶基因提高煙草的耐旱性[J]. 山東大學(xué)學(xué)報(bào)（理學(xué)版）， 2007， 42（1）： 89-94.

[10] 葉興國， 高 翔， 佘 茂，等. 小麥中果聚糖合成酶基因與抗旱性關(guān)系及其分子生物學(xué)研究[C]. 全國植物分子育種研討會摘要集， 2009： 157-158.

[11] 張樹珍， 王文治， 馬滋蔓， 等. 甘蔗根特異表達(dá)啟動子及其用途： 中國， 201010184837. 4[P]. 2011-01-19.

[12] 李 玲， 李娘輝， 冷佳奕，等. 植物生理學(xué)模塊實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 2009： 76-100.

[13] Khanna-Chopra R， Sinha S K. Prospects of success of biotechnological approaches for improving tolerance to drought stress in crop plants[J]. Current Science， 1998， 74（1）： 25-34.

[14] Livingston III D P， Hincha D K， Heyer A G. Fructan and its relationship to abiotic stress tolerance in plants[J]. Cellular and Molecular Life Sciences， 2009， 66（13）： 2 007-2 023.

責(zé)任編輯：古小玲