咖啡及其制品中咖啡因HPLC測定的前處理方法研究

鄒冬梅等

摘 要 采用5種前處理方法分別對5個樣品進行處理，并對HPLC測定咖啡因含量的前處理方法進行優化和改進，建立了3種準確、快速、安全的適宜不同樣品的咖啡因提取測定方法，其中三氯甲烷超聲萃取法效果最佳。該方法測定FAPAS對照樣品的咖啡因，其含量為395.47 mg/kg，相對誤差為0.9%，回收率達100.97%。該方法操作簡單、耗時少、精密度及準確度高、測定適用范圍廣。

關鍵詞 咖啡及其制品；前處理；咖啡因

中圖分類號 S571.2 文獻標識碼 A

Pretreatment Methods for Determination of Caffeine

in Coffee and Its Products by HPLC

ZOU Dongmei，YUAN Hongqiu， WU Qiong，

TANG Yongjiao， PANG Yongbo， XU Zhi

Analysis and Testing Centre， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract Five pretreatment methods were used for five samples of coffee and its products respectively. The methods for extracting caffeine and HPLC determination of caffeine content of the samples were optimized and improved， and three new methods for caffeine determination were established. And they are accurate， rapid， safe and suitable for extracting caffeine from different samples. The results showed that the method of chloroform together with ultrasonic extraction was the best， and using this method to determine the caffeine content of FAPAS control sample showed that its caffeine content was 395.47 mg/kg， the relative error was 0.9% and the recovery rate was 100.97%. Meanwhile， the method had advantages of simple operation， less time consuming， high precision and accuracy， and it had features of wide application.

Key words Coffee and its products；Pretreatment determination methods；Caffeine content

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.031

咖啡因（caffeine）又名咖啡堿，化學名稱為1，3，7，-三甲基黃嘌呤，屬生物堿類化合物。它具有等刺激中樞神經作用，對神經系統、心腦血管系統、消化系統、腫瘤化療的生化調節、神經官能癥和偏頭痛等均有一些積極作用[1-2]，但易上癮。目前，測定咖啡因的方法有高效液相色譜法、紫外分光光度法、薄層色譜法、碘量法、重量法和分子印跡毛細管整體柱液相色譜法等，常用的方法為高效液相色譜法（HPLC）[3-7]。傳統的HPLC測定前處理方法操作繁瑣，且咖啡因提取率不高，導致重復性差、準確度低。為建立準確、快速、操作簡便的咖啡因HPLC測定的前處理方法，本研究在現有相關標準基礎上對提取測定方法進行研究和優化，比較不同前處理方法咖啡因測定結果的差異性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 待測材料 樣品材料5個（表1），樣品經粉碎并過25目篩后待測。

1.1.2 主要試劑和儀器 咖啡因標準品（純度大于99.9%）購自國藥集團上海化學試劑公司；Waters 高效液相色譜儀（Waters e2695，配有2489紫外檢測器）。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 樣品前處理方法共5種，其中處理3～5為本研究建立的新方法，分別如下：

處理1：按照GB/T 19182-2003/ISO 10095：1992試樣處理方法[3]。

處理2：按照GB/T 5009.139-2003第二法高效液相色譜法[4]。

處理3：稱取樣品0.5～1.0 g（精確至0.000 1 g）于150 mL的錐形瓶中，先加2～3 mL超純水，再加50 mL三氯甲烷，加蓋搖勻，在超聲處理機上萃取5 min，靜置30 min，分層。將萃取液移入另一250 mL的錐形瓶中，在試樣中再加40 mL三氯甲烷，重復上述萃取操作步驟，棄去試樣，合并2次萃取液，加入5 mL飽和氯化鈉和少量無水硫酸鈉（至液面無水花），過濾100 mL容量瓶中（用三氯甲烷洗錐形瓶和濾紙2次），用三氯甲烷定容至100 mL。吸取10.00 mL濾液到50 mL蒸餾瓶中蒸干，用甲醇充分溶解并移入10 mL容量瓶中定容。吸取1～2 mL用0.22 μm微孔濾膜過濾至進樣瓶待測（棄去前3滴）。

處理4：分別稱取樣品1.0 g（精確至0.000 1 g）于150 mL 的錐形瓶中，加入4.0 g氧化鎂，再加入100 mL 蒸餾水，在恒溫振蕩水浴鍋中90 ℃水浴中浸提30 min，將溶液靜置，冷卻至室溫后過濾，濾液移入100 mL的容量瓶中，并用蒸餾水定容，稀釋10倍后，取1～2 mL過0.22 μm微孔濾膜過濾至進樣瓶待測（棄去前3滴）。

處理5：分別稱取樣品1.0 g（精確至0.000 1 g）于150 mL的錐形瓶中， 加入80 mL沸水， 加蓋搖勻，在恒溫振蕩水浴鍋中90 ℃水浴中浸提30 min，將溶液靜置， 冷卻至室溫，然后將浸出液全部移入100 mL容量瓶中， 加入2 mL醋酸鋅溶液（200 g/L）， 加入2 mL亞鐵氰化鉀溶液100 g/L， 搖勻， 用超純水定容100 mL， 搖勻， 靜置沉淀，過濾。準確吸取10 mL濾液至250 mL分液漏斗中，然后加入5 mL高錳酸鉀溶液（15 g/L）， 搖勻， 靜置5 min， 加入10 mL的亞硫酸鈉（100 g/L）和硫氰酸鉀（100 g/L）混合溶液（V ∶ V=1 ∶ 1），搖勻后，加入50 mL三氯甲烷。振搖100次（或2 min），靜止分層并收集三氯甲烷。在水層中再加入40 mL三氯甲烷，振搖100次（或2 min），靜置分層。合并2次三氯甲烷萃取液，并用三氯甲烷定容至100 mL，搖勻。吸10 mL濾液到25 mL蒸餾瓶中蒸干，用甲醇充分溶解并移入100 mL容量瓶中定容。取1 ～2 mL過0.22 μm微孔濾膜過濾至上機瓶待測（棄去最初3滴）。

1.2.2 準確度測定 參考物質測試：以表1中的樣品1（參考物質）為試樣，樣品前處理分別按1.2.1所述5種處理方法提取咖啡因并測定其含量。每種處理方法6個重復，比較測定值的平均值與樣品1（參考物質）參考值，以測定5處理種方法的準確度。

加標回收率測試：以樣品1（參考物質）為試樣，按1.2.1所述5處理種方法進行加標回收率試驗，每種方法3個水平的加標回收，即在稱取的樣品中分別添加200、300、400 μg的咖啡因。依據加標量及測定值計算每種處理方法各個水平的加標回收率，以比較5種處理方法的準確度。

1.2.3 精密度及測定適用范圍測定 按1.2.1所述5種前處理方法分別對4個不同咖啡因含量的樣品（編號分別為2、3、4、5）進行前處理并測定咖啡因含量。每種處理方法重復做6個平行，依據測定值計算其相對標準偏差（RSD范圍值≤2%），以比較5種處理方法的精密度及測定適用范圍。

1.2.4 標準溶液的配制 用萬分之一的電子分析天平稱取咖啡因標準品40.0 mg，將其移入50 mL的容量瓶中，并用超純水定容，即配得咖啡因標準品母液（500 μg/mL）。再用移液管精確移取0.5、1、1.5、2、3 mL 的母液，分別移入 50 mL的容量瓶中，并用超純水定容，即得到濃度為5、10、15、20、30 μg /mL的標準品溶液。

1.2.5 色譜條件 色譜柱：Sun Fire C18 柱（4.6 mm×150 mm； 5μm）； 流動相： 甲醇 ∶ 水（V ∶ V=30 ∶ 70）； 流速： 1 mL/min；檢測波長：272 nm；柱溫為 35 ℃。

1.2.6 色譜測定 分別對5個樣品的待測溶液進行測定，每個樣品重復6次，待測樣品進樣6次，記錄色譜圖，采用外標法計算其含量。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

通過Waters 高效液相色譜儀分析建立標準樣品的咖啡因色譜圖（圖1），咖啡因的保留時間約為4.4 min。以峰面積分值Y（μV·s）為縱坐標，標準溶液濃度X（μg/mL）為橫坐標繪制標準曲線（圖2），計算回歸方程，咖啡因標準曲線方程為：Y=2.626 78 X+1.233 13；相關系數R2=0.999 9。

2.2 5種處理方法的準確度比較

2.2.1 5種不同前處理方法的測定值與參考物質的比較 由表2可知，處理1和處理2所測定的咖啡因含量分別為132.68、216.16 mg/kg，低于對照樣品，相對誤差分別為45.8%、66.7%；處理3～5所測定的咖啡因含量分別為395.47、367.36、376.99 mg/kg，與對照樣品相比，相對誤差分別為0.9%、7.9%和5.5%，其中處理3的準確度最高。除處理1測定的咖啡因含量的RSD值<2%外，處理2～5的咖啡因含量的RSD值均小于2，說明這4種處理方法的測定精密度較高。

2.2.2 加標回收率結果 由表3可知，5種處理方法的回收率分別為39.13%、69.27%、100.97%、96.68%和94.12%，RSD值分別為1.84%、1.94%、0.60%、1.55%和1.71%，其中處理3的回收率（正常范圍為80%～120%）最高，準確度也最高。

2.3 3種新前處理方法的精密度與重復性比較

分別采用處理3、4、5對樣品2、3、4、5進行前處理測定咖啡因含量，精密度試驗結果如表4，重復性試驗結果如表5。3種處理方法的RSD值均小于2%，說明3種處理方法的精密度高。在重復性試驗中，每個樣品重復6次，每次重復進樣6次，計算6組的咖啡因含量平均值，RSD值也均小于2，說明3種處理方法的重復性好。因此，3種前處理方法適用于不同樣品的咖啡因含量測定。

2.4 5種前處理方法的綜合比較

由表6可知，處理3最準確、簡單、快速、安全，峰型好、雜質峰少（圖3），適用于精密測定咖啡及其制品中的咖啡因的含量，處理4和5準確度較好，處理4適用大批量樣品的快速測定，處理5沒有雜質峰，可用于科研分析或提取純化咖啡因。

3 討論與結論

本研究建立了3種準確、簡單、快速、安全的適合不同樣品的咖啡因前處理定方法，即處理3、處理4、處理5。其測定結果明顯優于目前的國家標準（GB/T 19182-2003和GB/T 5009.139-2003），即處理1和處理2。主要存在以下改進：

處理3（三氯甲烷超聲萃取法）在處理2的基礎上進行了改進，測定方法準確、精密。該方法的超聲萃取時間由處理2的1 min變為5 min，色譜條件采用GB/T 19182-2003。2013年8月，筆者參加FAPAS的能力驗證（全球共73家單位參加），采用處理3提取樣品2和樣品3（考核樣）并測定咖啡因含量，標準分數（z-score）值分別是-0.1和0.2。標準分數的絕對值小于或等于2，則通過能力驗證，說明處理3測定結果的準確度高并獲得國際認可。

處理4（90 ℃水浴浸提取法）在處理1的基礎上進行了改進，測定方法安全、簡便、高效。該方法在水浴浸提時間和純化等方面進行改進，由處理1和國際標準（ISO 20481-2008）在恒溫振蕩水浴鍋中90 ℃水浴中浸提20 min變為30 min，同時省去了提取液質量稱重、溶液的提純、咖啡因的吸收、脫除不需要的化合物、咖啡因的洗提等5個步驟，溶液冷卻過濾后直接上機測樣。但是該前處理提取的咖啡因含雜質較多，影響準確度和色譜柱的使用壽命。

處理5（90 ℃水浴中浸提，三氯甲烷萃取法）的色譜峰較純凈且準確，該方法綜合了處理1和處理2，即90 ℃水浴中浸提30 min后采用GB/T 5009.139-2003中紫外分光光譜法的試樣處理，但操作較繁瑣。

我國農業標準一般每3～5年修訂1次，但現行有效的國家標準（GB/T 19182-2003和GB/T 5009.139-2003）標齡已有10 a，它不但操作繁瑣，而且在溶液提純過程中既難操作又不經濟，準確度和重復性也較差，建議有關部門盡快修訂該標準。本研究中，處理1和4以90 ℃水浴浸提取，沒有使用有害的有機溶劑，相對于其它3種方法的安全性更高；其余3種提取方法使用三氯甲烷（低毒，對環境有危害，對水有污染）作為提取劑，如果操作人員經過專門培訓，嚴格遵守操作規程（密閉操作，局部排風），對人和環境不會造成明顯的安全問題。三氯甲烷超聲萃取法作為測定咖啡及其制品中咖啡因含量的前處理方法，其效果最佳，該方法具有操作簡單、耗時少、精密度和重現性好、回收率高、測定適用范圍廣等特點，將為今后咖啡及其制品中咖啡因含量的測定提供技術參考。

參考文獻

[1] 趙靈芝， 蘇興文， 銀 巍，等. 咖啡因對苯妥英誘導的小腦顆粒神經元凋亡的保護作用及機制[J]. 中國藥理學通報， 2004， 20（12）： 1 370-1 374.

[2] 韓洪波， 楊春琳， 李敏杰. HPLC測定小粒種咖啡不同部位咖啡因含量[J]. 食品研究與開發， 2013， 34（6）： 85-88.

[3] ISO 20481﹕ 2008 Coffee and coffee products Determination of the caffeine content using high performance liquid chromatography（HPLC）-Reference method[S]. International Organization for Standardization， 2008.

[4] 國家質量監督檢驗檢疫總局. GB/T 19182-2003/ISO 10095：1992 咖啡-咖啡因含量的測定-高效液相色譜法[S]. 北京： 中國農業出版社， 2003.

[5] 中國國家標準化管理委員會. GB/T 5009.139-2003飲料中咖啡因的測定[S]. 北京： 中國農業出版社， 2003.

[6] 李 蔚， 蘇 黎，陳金東. 食品中咖啡因含量的測定方法[J]. 中國衛生檢驗雜志， 2008， 18（11）： 2 194-2 196.

[7] 董悅涵. 高效液相色譜法測定飲料中咖啡因含量研究[J]. 現代農業科技， 2012（6）： 280-281.

責任編輯：古小玲