魚類腸道外源乳酸桿菌DNA提取樣品前處理優化

張雯

摘 要：優化魚類腸道外源乳酸桿菌DNA提取的方法。樣本勻漿后加入PEG8000（40%）1000rpm離心10min，可以沉淀并去除影響DNA提取質量及抑制Real-timePCR反應的雜質。平板計數結果顯示，對比未處理前樣品，離心上清保留90%以上的菌液，同時雜質的去除大幅度地降低了樣本的背景值。本研究為優化魚類腸道外源乳酸桿菌定量分析體系提供理論依據。

關鍵詞：DNA提取；前處理；微生物多樣性定性定量

目前國內外對腸道乳酸桿菌的定量方法主要有培養法和免培養法。培養法主要采用對腸內容物樣本平板計數法，是最原始的計數方法，易操作好掌握，成本低，但耗時長，且只能檢測活菌數量。在多種免培養法中，Real-time PCR技術已廣泛運用于各個領域的微生物定量中，一般步驟包括樣本前處理、DNA提取、PCR計數，該方法最主要的優勢為不僅可以計數活菌還可以計數死菌量，大量研究表明，死菌同樣具有益生功效，通過特異性引物的設計可以達到絕對定量。

本研究旨在優化腸道外源添加乳酸桿菌定量方法體系，確定針對于魚類腸道樣本前處理的最佳方法，解決快速、準確定量魚類腸道外源添加乳酸桿菌的計數方法。為以后深入研究菌群代謝提供技術依據。

一、材料與方法

1.材料

（1） 試驗動物。

羅非魚1.5～2.5g（貴州省羅甸羅非魚養殖場），斑馬魚0.3～0.5g（貴州省都勻市觀賞魚市場）。正式試驗進行前，試驗動物均在適宜條件下暫養，確保其健康。

（2） 試驗菌株。

菌株來源于中國農業科學院飼料研究所水產研究室保存菌株。在MRS培養基中靜置37℃培養12 h。

（3） 試劑耗材。

PEG8000，MRS液體培養基，MRS固體培養基（oxide），溶菌酶粉末，溶菌酶緩沖液，5M NaCl，CTAB/NaCl，氯仿，異戊醇，tris飽和酚，乙醇，20×TE緩沖液，10%SDS，蛋白酶K，100μm、40μm細胞過濾器（Biologix，美國），DNA小提試劑盒（Qiagen，德國）。

（4） 主要儀器。

T10勻漿器（IKA，德國），TDZ5-WS 多管架臺式離心機（湖南湘儀），SPX-80生化培養箱（寧波江南儀器廠），Gel Doc XR+凝膠成像儀（Bio-rad，美國）等。

2.方法

（1）樣本前處理優化。

JCM1149為MRS卡納抗性，卡納濃度12.5ng/ml。對于方法A和方法B，選取羅非魚12條，上午10點喂食，下午2點腸道取樣。其中11條每條腸道均添加JCM1149菌液1ml。1條羅非魚腸道直接勻漿稀釋涂板。菌液稀釋涂板計數。

方法A：震蕩靜止取上清法對比常規勻漿處理。4條剪開腸道較為強烈的震蕩（1200rpm/min），靜止，取上清，4條為全腸勻漿，處理后五個重復梯度稀釋涂板（卡納抗性MRS板），剩余樣本12000rpm，5min離心，留沉淀于-80℃，用于DNA提取。

方法B：3條勻漿后再加入MRS1ml，100um濾網過濾，濾液經過40um濾網再次過濾，留濾液2ml梯度稀釋涂板。涂板后，12000rpm，5min離心，沉淀于-80℃。

方法C：在10ml，20%，40%PEG8000中分別加入2ml菌液，1000rpm離心10min，20min后取上清2ml，上清下1ml，剩余9ml混勻后稀釋涂板，梯度稀釋，3個重復。計數經過不同濃度的PE8000，不同離心時間前處理后的菌落數，比對未經處理JCM1149純菌數，計算此方法的回收率。

方法D：將JCM1149菌液，加入9ml滅菌后的MRS中，終體積10ml；取2條羅非魚腸道，于上一步10ml含JCM1149菌液的PBS中，充分勻漿，混勻。取4個15ml細胞離心管分別加入10ml40%PEG8000，于上層分別緩慢加入2ml勻漿后樣本，分別以不同轉速（1000rpm，1500rpm），不同時間（10min，20min）離心；取離心后上清，上清下1ml，剩余液體9ml混勻分別梯度稀釋，3個重復，涂板計數；JCM1149原液梯度稀釋涂板計數。涂板稀釋后剩余樣本均12000rpm，5min離心，留沉淀于-80℃，用于DNA提取。

二、結果與分析

1.樣本前處理優化結果

不同方法前處理羅非魚腸道，比較回收率，可見震蕩靜止取上清方法獲取的目的菌約為原始勻漿方法的50%，而100μm，40μm濾網過濾只占添加菌液的15.64%（表1）。當PEG80000濃度是40%，且離心時間為1000rpm，10min時JCM1149菌液回收率最高，高達91.04%（表2），進一步摸索對于羅非魚腸道PEG8000前處理的最佳離心轉速和時間，結果當PEG80000濃度是40%，且離心時間為1000rpm，10min時回收率最高（表3），這與之前試驗結果相符，且PEG8000處理，可沉淀大量雜質（圖1）。因此，后面試驗均使用40%PEG8000，1000rpm，10min離心作為DNA提取前處理樣品。

三、討論

羅非魚屬于雜食性，腸道菌群多樣化（Saravanan and Geurden et al. 2012），勻漿方式前處理腸道樣本回收率最高，且大于100%，分析是復雜的腸道菌群結構，含有部分適應該濃度卡納抗性的菌群所致。而震蕩取上清方法，對于沉淀的時間較難把握，過短則不能沉淀大量雜質，過長則使大量細菌沉淀，降低回收率。過濾法，二次過濾，濾網孔徑較小，由于雜質的存在，容易堵塞濾孔，所需時間冗長，更換濾網造成更大損失，但擴大濾網孔徑，則不能很好的除去雜質。

PEG（polyethylene glycol，聚乙二醇）是一種高分子滲壓劑，用于對樣本的沉淀，分離純化作用，可用來沉淀蛋白質等（Matsuda and Waldo et al. 1988）。有研究用PEG處理對云南松種子，研究其對種族發芽及生理生化特性的影響。結果表明， PEG處理種子發芽率、可溶性糖、可溶性蛋白含量均有顯著變化（王曉麗與曹子林等， 2012）。不同分子量的PEG聚乙二醇，分子量的大小會影響PEG在粒子上的吸附牢固程度及粒子的相互作用，PEG鏈長過短，粒子易脫落，過長則使粒子不易脫落（施一鳴與單國榮， 2013）。聚乙二醇沉淀（PEG8000）可以沉淀小球藻病毒FJ-1，最佳使用量為 PEG8000 7%和4%氯化鈉，但PEG8000的沉淀效率低于超速離心法（Han and Kang et al. 2000）。免疫學上，對于循環免疫復合物的沉淀，PEG也有好的結果（Herreman and Godeau et al. 1978）。研究疾病時，從血漿中獲得的沉淀物用PEG重懸純化，得到的在PEG中的沉淀物再次重懸，進行后續研究，有很好的純化作用（Ristol and Gensana et al. 1996）。20%PEG8000濃度過低，不足以阻止含所需樣本的MRS層停留在上清，導致目的菌沉入上清以下的部分。

對比純菌涂板結果，40%PEG8000處理后回收率最高，可以初步確定PEG8000用于樣本前處理的可行性，但隨著離心轉速和離心時間的增長，回收率顯著降低，表明離心轉速與回收率高低密切相關。為了進一步確定合適的離心時間和離心轉速，因此降低增大的離心轉速，由2000rpm改為1500rpm，再次驗證，結果仍然為1000rpm，10min回收率最高，且1500rpm，20min回收率顯著降低。MRS上清于PEG8000分界線不顯著，出現彌散現象，結果證明隨著離心轉速增大和離心時間的增長，使大量目的菌離開含MRS上清，向PEG8000層移動，導致回收率降低。

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