水產種苗中氯霉素殘留量的測定前處理方法的改進

胡浩光　彭家杰　劉少彬　李緒鵬

摘要：本文對氣相色譜法測定水產種苗中氯霉素的各種影響因素進行探討，分析了樣品提取和脫脂凈化過程對檢測結果的影響，并對上述環節進行改進。結果表明：改進后的前處理，實驗成本低，加快實驗速度，提高了回收率，適用于批量樣品同時檢測工作的需要。

關鍵詞：氯霉素；水產品；氣相色譜；前處理

中圖分類號：0657.7 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20161232003

氯霉素（chloramphenicol）是由委內瑞拉鏈絲菌產生的抗生素。屬抑菌性廣譜抗生素，被廣泛用于治療各種敏感菌感染，故此在水產養殖業中被得到廣泛應用。但由于氯霉素能抑制骨髓造血功能，造成過敏反應，引起再生障礙性貧血（包括白細胞減少、紅細胞減少、血小板減少等），此外還可引起腸道菌群失調及抑制抗體形成）等危害，嚴重威脅人體健康，已成為人類的隱形殺手。因此對于水產養殖藥物殘留的檢測尤見重要。目前對于氯霉素藥物殘留的檢測方法，主要有GC法、酶聯免疫法（ELISA）、負化學源GC-MS測定法、LC法、超高效液相法、LC-MS-MS法、微生物法、放射免疫法等。目前檢測機構主要采用氣相色譜法，但由于其樣品前處理過程繁瑣復雜，耗時長，易出現回收率偏低的情況，對于批量樣品的檢測，尤見不合適。為此本文根據實際檢測工作，在行業標準DB44/T 543 2008的基礎上，探討并改進了提取、萃取等影響檢測的環節，對前處理進行簡化，進一步提高方法的回收率和簡化前處理步驟，節省測定時間和成本，進一步優化各個要素，提高了回收率和工作效率。

1材料與方法

1.1標準品與試劑

氯霉素標準品，純度≥98.5%（德國Dr.EhrenstorferGmbH公司）；甲醇、乙酸乙酯，正己烷均為色譜純（美國Fisher scientific飛世爾實驗器材（上海）有限公司）；試驗用水為超純水（東莞市怡豐貿易有限公司），18.2MΩ.cm；無水硫酸鈉為分析純（在馬弗爐中650℃灼燒4h，冷卻后置干燥器內中備用）；氯化鈉為優級純（汕基金項目：東莞市科技計劃資助項目（項目編號：K10017K）頭市西隴化工有限公司）；衍生化試劑：BSTFA/TMCS體積比為99：1（美國Supelco公司），Milli-Q超純水系統（美國Millipore公司）。

1.2儀器與設備

氣相色譜7890（美國安捷倫公司）；離心機（德國SIGMA公司）；電子天平：感量0.0001；MS1渦旋振蕩器（德國IKA公司）；KQ-300VDE型超聲波提取儀（昆山市超聲儀器有限公司），氮吹儀（美國），超純水儀（美國Millipore公司）。

1.3實驗方法

1.3.1樣品提取

準確稱取均質水產種苗樣品1.00g于15mL聚四氟乙烯離心管中，加入5mL乙酸乙酯，旋渦混合器混合30s，超聲10min，4000ffmin離心3min。將乙酸乙酯層轉移到50mL聚四氟乙烯離心管中，再重復提取1次，合并乙酸乙酯提取液于50mL聚四氟乙烯離心管中，于50～55℃水浴中吹氮蒸發至近干。

1.3.2脫脂凈化

向離心管中加0.5 mL甲醇旋渦混合溶解殘留物，加10 mL正已烷和10mL 4%氯化鈉溶液，旋渦混合1.5min，充分混合提取脂肪，4000r/min離心3min，棄去正已烷相。水相中加入7mL乙酸乙酯，旋渦混合器混合1.5min，4000r/min離心3min，吸取乙酸乙酯層，經過無水硫酸鈉柱脫水過濾于15mL具塞玻璃離心管中，再重復提取1次，用洗耳球擠壓無水硫酸鈉柱，在50-55℃水浴中吹氮蒸發至干。

1.3.3衍生化

向干的殘留物中加100μL衍生物試劑，蓋塞并旋渦混合10s，在70℃烘箱中反應30min。再在50～55℃水浴中，用氮氣吹走多余的試劑，至樣品管剛好吹干為止（注意：此步過長的吹干時間可導致丟失分析物）。加入1mL正已烷，旋渦混合10s，供氣相色譜分析用。

1.4氣相色譜測定

1.4.1氣相色譜測定條件

色譜柱：HP-5石英毛細管柱（30m×0320mm×025gm），進樣量1μL。脈沖不分流進樣，脈沖壓力為30psi，脈沖時間為0.75min。升溫程序為：初溫200℃，保持1min；20℃/min至250℃，保持10min，然后設定15℃/min升至280℃，保持2min。進樣口溫度26012，檢測器溫度為300～C。載氣為氮氣，流速1.2mL/min。外標法定量。

1.4.2標準溶液的配制

精確稱取氯霉素標準品0.0250g，用甲醇溶解后定容到50mL容量瓶中，配制成500ug/mL的標準溶液，于冰箱冷藏儲存。使用前根據需要稀釋成不同濃度。

2結果與討論

2.1條件優化

2.1.1樣品轉移的優化

DB44/T 543-2008的樣品處理流程為“稱樣到離心管-轉移到雞心瓶-轉移到離心管-轉移到雞心瓶-轉移到具塞圓底離心管-吹干-定容”，如此反復的轉移定會引起樣品的損失，且耗時。本實驗采用“稱樣到加塞10mL離心管-轉移到50 mL離心管-15 mL離心管吹干-定容”。這樣既減少了轉移的次數和實驗步驟，同時縮短了檢測時間，減少了試劑用量，保證了回收率。

2.1.2濃縮和凈化的優化

DB44/T 543-2008方法每次只能將一個樣品用雞心瓶在40℃水浴條件下減壓旋轉蒸發至干；而本實驗中采用50mL的聚四氟乙烯離心管代替雞心瓶，每次可同時處理24個樣品，在氮吹儀上，于40℃水浴條件下，氮吹蒸發至干，操作簡便快捷，濃縮效果明顯提高。

在DB44/T 543-2008方法中，樣品采用1次脫脂，2次反萃取，1次提取和2次蒸餾過程進行凈化，縱然能達到較好的除雜效果，可耗時、繁瑣、樣品溶液轉換次數較多，大大影響了實驗回收率。而本實驗對此進行改進，用離心管代替雞心瓶，脫脂和反萃取的時候，進行離心，溶液分層清析，縮短了實驗步驟。實驗結果表明，該方法不僅提高凈化效果，操作方便，降低檢驗成本，而且效果好，回收率滿足日常檢測要求。

2.2色譜圖比較

分別采用DB44/T 543-2008方法（A）和改進后的方法（B），進行草魚樣品和草魚加標樣品的檢測，得到圖譜如圖1-3所示。圖1為氯霉素標準品色譜圖；由圖2和圖3（草魚基質和在草魚基質添加0.2 mL 50ng/mL氯霉素）可以看出，采用方法A的干擾雜質相對較多，而且基線不平穩，按照實驗方法1-3操作進行，采用方法B的圖譜基線平穩，基線噪聲低，干擾雜質相對較少，且目標物區分清晰。

2.3線性范圍和檢出限

用甲醇配制質量濃度依次為1.00、5.00、10.00、25.00、50.00、75.00和100.00ng/mL的氯霉素標準溶液，測定其峰面積相應值，以峰面積對應的質量濃度做工作曲線。當進樣量為1μL時，氯霉素在質量濃度為0.5-100.00ng/mL的范圍內呈良好的線性關系，線性方程為Area=34.1232795×Amt+8.6549223，線性系數r=0.9996。在本方法測定條件下，按信噪比S/N=3所對應的濃度為依據計算檢出限，得到氯霉素的檢出限為0.27μg/kg。

3回收率及精密度試驗

取陰性樣品，加入水平分別為5μg/kg、10μg/kg、和15μg/kg標樣，每組水平7次平行樣，按上述實驗條件，進行加標回收率實驗。試驗數據見表1所列。氯霉素的回收率在74.6%～87.6%之間，重復性較好，RSD值為1.2%～1.9%，因此該方法的準確度和精確度均可以滿足測定要求。

4結論

本實驗在DB44/T 543-2008的基礎上進行了改進，簡化實驗步驟，提高工作效率。結果表明，DB44/T 543-2008經本文改進后，回收率高，精密度好，適用于水產品中氯霉素留量的檢測。