基于AFM的人參水提物對VERO細胞氧化損傷作用研究

劉暢 曲英敏 李景梅

摘要[目的]研究人參水提物對VERO細胞在體外培養中的氧化損傷。[方法]采用細胞體外培養技術、MTT比色法、SOD和MDA試劑盒法、原子力顯微鏡（AFM）觀察法，研究人參水提物對VERO細胞氧化損傷的機制。[結果]人參水提物對VERO細胞能夠起到明顯的增殖抑制作用。人參水提物對VERO細胞具有一定的的氧化損傷作用且有一定的劑量及時間依賴性。原子力顯微掃描成像結果表明正常生長的VERO細胞表面光滑、細胞體積飽滿，而人參水提物處理組細胞膜損壞現象明顯，細胞表面的粗糙度較大。[結論]人參水提物對VERO細胞具有一定的氧化損傷作用，其作用機制可能與細胞膜的損傷有關。

關鍵詞人參水提物；VERO細胞；原子力顯微成像；氧化損傷

中圖分類號TQ028.0文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）01-00113-04

基金項目吉林省科技廳項目（201215136）。

作者簡介劉暢（1987-），女，吉林長春人，碩士研究生，研究方向：生物材料，Email：165652403@qq.com。*通訊作者，教授，博士，碩士生導師，從事生物材料研究，Email：ljm3023@126.com。

收稿日期20131210人參是我國的一種傳統中藥[1]，但關于其毒性的報道較少。研究表明，人參水溶性蛋白對VERO細胞的體外增殖具有一定的抑制作用[2]。VERO細胞來源于非洲綠猴腎，具有無限增殖的特點，常用于藥物對腎臟毒性影響的試驗[3]。唐蕊華等[4]通過原子力顯微鏡（AFM）對細胞表面掃描成像手段觀察Vero-E6細胞在被漢坦病毒感染前后細胞表面形貌的變化，結果表明使用AFM掃描經不同稀釋度的漢坦病毒處理的細胞表面，發現細胞表面粗糙程度、細胞表面的空洞數量均發生一定的改變，采用AFM技術可以通過觀察細胞表面超微結構的變化粗略判斷出病毒感染細胞的動態過程。筆者采用傳統的中藥煎煮法制備人參水提物，以非洲綠猴腎細胞作為人參水提物的受試細胞，探討人參水提物對腎細胞的毒性。

1材料與方法

1.1材料與儀器 1640培養基（Gibco公司）、胎牛血清（FBS，杭州四季青公司）、胰酶（Trypsin，長春天佳公司）；噻唑蘭（MTT，Sigma公司）、二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司）、鮮人參（購于吉林農業大學，產地為吉林省撫松地區）、SOD試劑盒（南京建成生物工程研究所）、MDA試劑盒（南京建成生物工程研究所）、CO2培養箱（日本三洋公司）、原子力顯微鏡（N9410S，Agilent）。

1.2提取物的制備取鮮人參根50 g，剪碎，加入700 ml蒸餾水，100 ℃條件下提取4 h，紗布過濾。濾渣重復提取2次，每次4 h。將3次所得濾液合并，60 ℃水浴濃縮至50 ml，離心（4 500 r/min，15 min），棄去沉淀。得到的上清即為人參水提物（WEG）。將WEG置于60 ℃水浴繼續濃縮，冷凍干燥后用少量無菌培養液將其溶解，原始濃度為200 mg/ml，用0.22 μm濾膜過濾除菌。用培養液稀釋成所需要的濃度。

1.3體外試驗方法

1.3.1細胞培養及傳代。將VERO細胞用含10%滅活胎牛血清的RPMI1640完全培養液按照1×105個/ml的濃度接種于無菌培養瓶內，置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2的培養箱內。0.25%胰酶消化液消化傳代，3～4 d傳代1次。試驗所用VERO細胞均處于對數生長期。

1.3.2MTT法檢測WEG對VERO細胞的影響。 將VERO細胞用含8%滅活胎牛血清、1%雙抗的RPMI1640完全培養液按照1×105個/ml的濃度接種于培養瓶內，置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2（95%空氣）培養箱內。0.25%胰酶消化傳代，3～4 d傳代1次。試驗所用VERO細胞均處于對數生長期。

采用MTT比色法檢測人參水提物（WEG）對VERO細胞的增殖抑制作用。收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度至105個/ml，取若干塊無菌96孔細胞培養板，使每孔加入100 μl含有上述懸浮細胞的培養液，靜置，移至培養箱內培養24 h后，棄去原培養液。加入不同濃度的人參提取液，用培養液補足至200 μl，使每孔中藥物的終濃度為20、40、60、80、100 mg/ml，對照組加入空白培養液。每組設6個復孔。將培養板置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2（95%空氣）培養箱中培養3 d后，每12 h取出一塊培養板，每孔加入20 μl MTT溶液，繼續培養4 h。終止培養，小心吸去孔內培養液。每孔加入150 μl DMSO，置于搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。每組試驗重復3次。在酶標儀上以空白孔為對照調零，在波長490 nm處測定各孔的吸光度值，計算細胞增殖抑制率，計算IC50值，以時間、濃度為橫軸，以光吸收值（A）、增殖抑制率為縱軸，繪制相應曲線。

抑制率=（1-A490加提取液組細胞吸光值/A490對照組細胞吸光值）×100%

1.3.3WEG對VERO細胞氧化損傷的影響。按照SOD試劑盒、MDA試劑盒說明書中的方法，對不同濃度WEG處理24 h的VERO進行SOD活性、MDA含量的檢測。每組試驗重復3次。

1.3.4VERO細胞的AFM探測。將經75%乙醇溶液浸泡消毒的蓋玻片置于無菌6孔板細胞培養板中，接種對數生長期的VERO細胞，調節細胞密度105～106個/ml，每孔2 ml。培養24 h，吸出培養基并加入WEG，使每孔藥物的終濃度為20、40、60、80、100 mg/ml，對照組加入空白培養液。培養48 h后，棄掉培養基，加入無菌PBS輕輕沖洗每孔。棄掉PBS，每孔加入2.5%戊二醛固定細胞15 min。棄掉戊二醛，用超純水洗滌蓋玻片3次。將制備好的樣品置于原子力顯微鏡的XY掃描臺上，用監視器定位所要掃描的樣品區域，輕敲模式成像。試驗采用100 μm掃描器，標準硅探針，微懸臂的彈性系數為40 N/m，共振頻率為300 kHz，獲得圖像像素為512×512。AFM圖像以自帶軟件Pico Image Basic 6.2處理。每組試驗重復3次。

1.4數據統計與分析所有數據采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，組間數據采用獨立樣本t檢驗法進行兩兩比較分析，數據均以±s表示，P<0.05表示差異顯著。MTT中的抑制率曲線采用Origin 8.0軟件進行分析處理。

2結果與分析

2.1不同濃度人參水提物對VERO細胞體外增殖的影響不同濃度的人參水提物（WEG）均對VERO細胞起到不同程度的增殖抑制作用。從圖1可以看出，隨著WEG濃度的增加，試驗組VERO細胞存活數量明顯降低。

2.4WEG對VERO細胞氧化損傷的影響由表1可知，與對照組相比，各濃度WEG組的SOD活性呈明顯低于對照組，各組MDA含量明顯高于對照組（P<0.05）。隨著WEG濃度的升高，各組SOD活性相應降低，各組MDA含量對應性升高。這說明人參水提物對VERO細胞的正常生長起到了破壞作用，使細胞受到損傷。

2.5原子力顯微鏡對VERO細胞的觀測結果基于原子力顯微鏡在納米尺度上的觀測技術對VERO細胞進行細胞結構上的探測，希望能夠從WEG對VERO細胞結構上的影響來探討WEG對VERO細胞體外增殖的抑制作用。取經20、40、60、80和100 mg/ml WEG培養2 d的VERO細胞，每組至少用AFM掃描成像10個細胞，獲得掃描范圍為80 μm×80 μm的VERO細胞及表面超微結構圖（圖4）。

3討論

中草藥被認為毒副作用小、使用安全，但仍有許多因用藥不當而引發不良反應的報道[5]。人參的主要活性成分是人參皂苷和人參多糖，其中關于人參皂苷的研究主要集中于改善機體免疫力、對心腦血管的保護作用、抗腫瘤作用等[6]，且研究大多局限于動物試驗，其應用于臨床實踐的藥理作用仍需大量研究。據報道，當將一定濃度的人參提取物添加到新生大鼠心肌培養基中時，新生大鼠心肌細胞出現跳動異常的現象，其濃度經連續稀釋以后，心肌細胞跳動異常情況隨之消失，但當將相同濃度的人參提取物添加到成年大鼠的心肌細胞的培養基中時，心肌細胞未見異常[7]。這說明人參提取物對新生大鼠的心肌細胞具有一定的毒性。

細胞的形貌、結構與細胞的生理狀態和功能有著重要的聯系，AFM對細胞表面形貌學研究與臨床研究的關系越來越密切，并具有著廣闊的應用前景[8]。筆者通過AFM對WEG作用的VERO細胞前后形貌、超微結構的對比，從納米尺度上直觀觀察WEG對VERO細胞形貌、結構的變化，通過對結構的觀察探索WEG對VERO細胞增殖抑制的機理。WEG能明顯抑制VERO細胞的體外增殖，并對VERO細胞具有一定的氧化損傷作用，通過原子力顯微鏡探測技術的引入，經掃描成像發現WEG對VERO細胞的細胞膜具有一定的破壞作用。據此推斷，WEG對可能對人體的腎臟具有一定的損傷作用，隨著WEG濃度的降低，對腎臟的損傷作用有所減輕，其可能的作用機制有待進一步研究。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2010版）[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：8.

[2] 李紅艷，趙雨，張巍，等.人參水溶性蛋白對幾種細胞增殖的影響[J].吉林農業大學學報，2008，30（5）：705-707.

[3] SHIMIZU B，SENO K，KOYAMA H，et al.Manual of selected cultured cell lines for bioscience and biotechnology（in Japanese）[J].Tokyo：Kyoritsu Shuppan，1996，18（2）：299-300.

[4] 唐蕊華，薛小平，尹煥才，等.用原子力顯微鏡觀察漢坦病毒感染前后VeroE6細胞的形貌變化[J].中國實驗診斷學，2008，12（5）：598-601.

[5] 李慶虹，山麗梅，任永申.中藥毒性研究進展[J].中華中醫藥雜志，2007，22（5）：300-302

[6] JONG D P，DONG K R，YOU H L.Biological activities and chemistry of saponins fron Panax ginseng C.A.Meyer[J].Phytochemistry Reviews，2005，4：159-175.