割手密種質資源遺傳多樣性的ISSR分析

劉建樂等

摘 要 為探討國內割手密種質資源的遺傳多樣性，本研究采用ISSR分子標記對采自8省的52份割手密種質資源進行了分析。結果表明，22條ISSR引物共擴增出127條條帶，其中多態性條帶121條，多態率達95.3%。材料間遺傳相似系數GS在0.60～0.91之間。UPGMA聚類分析結果表明：在遺傳相似系數0.72時52份材料可分為4大類；ISSR分析結果顯示，割手密遺傳多樣性豐富，可以用ISSR對割手密進行分子水平的鑒定和遺傳多樣性研究。

關鍵詞 割手密；遺傳多樣性；ISSR；SDS法

中圖分類號 S566.1 文獻標識碼 A

Genetic Diversity in Saccharum spontaneum L.

Based on ISSR Markers

LIU Jianle1，2， BAI Changjun1 *， YAN Linling1， YANG Hubiao1

ZHANG Long1，2， HUANG Chunqiong1

1 Tropical Crops Genetic Resources Institute， CATAS / Key Laboratory of Tropical Crops Germplasm Utilization，

Ministry of Agriculture， Danzhou， Hainan 571737， China

2 College of Agronomy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract In order to analyze the genetic diversity of Chinese S. spontaneum L.， a toatal of 52 S. spontaneum L. was used and ISSR markers were apllied. With 22 ISSR primers， 127 loci were detected among which 121 were polymorphic， indicating considerable genetic variations at the species level.The genetic similarity among all accessions was ranged from 0.60 to 0.91. The 52 S. spontaneum L. were clustered into four groups by UPGMA when GSC was 0.72. The study indicated that ISSR produced high polymorphism on S. spontaneum L. and could be used in the study of the molecular evaluation and studies of genetic diversity of the S. spontaneum L. germplasm.

Key words Saccharum spontaneum L.； Genetic diversity； ISSR； SDS methods

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.012

割手密（Saccharum spontaneum L.），又名甜根子草，為禾本科（Gramineae）甘蔗屬（Saccharum）多年生草本植物[1]。割手密的適應性強，分布范圍廣，在我國北緯18°15′～33°20′，東經97°～122°海拔1～2 460 m的地區均有分布[2]，是當前世界范圍內甘蔗育種中抗逆性、分蘗性、適應性等優良性狀的主要來源[3]，但目前甘蔗育種面臨親本資源匱乏，品種間遺傳背景狹窄，盲目性、重復性等問題。因而從分子水平上揭示割手密遺傳資源的多樣性，確立分子標記輔助育種技術非常重要。

簡單重復序列區間（inter-simple sequence repeats，ISSR）PCR技術是1994年加拿大蒙特利爾大學的Zietikiewicze[4]提出的。其原理是在SSR的3′或5′端錨定1～4個核苷酸，進而對反向排列的SSR間的一段DNA 進行擴增。該技術不僅克服了SSR和RAPD技術的某些缺點而且具有多態性高、重復性強、DNA用量少、操作簡單、快速、高效等優點[5]。目前該技術已應用于甜橙[6]、扁穗牛鞭草[7]、狗牙根[8]、野牛草[9]、尤氏針茅[10]等植物種質資源的研究，并取得了較好的成果。對于割手密，Chen等[11]通過分子聚類分析，推論出我國割手密起源于云南。楊清輝等[12]選用6個隨機引物對32份不同緯度、不同海拔、不同染色體數目的割手密作RAPD分析，結果表明，供試的32份割手密具有豐富的多態性，可劃分為9個類群。樊麗娜等[13]對廣東地區的67個割手密種質采用Genomic-SSR和EST-SSR標記分析，結果表明，廣東割手密之間的遺傳關系存在顯著地由南向北的地理分化，但利用ISSR分子標記技術對割手密種質資源的研究尚未見報道。本研究應用ISSR技術首次對采集的52份割手密進行了遺傳多樣性分析，在分子水平上探討了其遺傳多樣性，旨在對割手密種質資源的保護鑒定、利用及以后的育種工作提供必要的參考。

1 材料與方法

1.1 材料及來源

本研究材料來自中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所牧草中心種質資源圃（表1），2013年5月初齊地割掉地上部分，6月1號在每個資源圃中隨機挑選15株割手密，每株剪取幼嫩健康、無病斑的葉片若干，裝入編號袋，用冰盒帶回實驗室，-80 ℃條件下保存備用。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 將SDS法改良用于提取割手密的DNA。（1）取1～2 cm葉片剪碎，放入預冷的研缽中，用液氮充分研磨成粉末，將粉末狀材料迅速轉入滅菌的2 mL離心管，加入65 ℃預熱的SDS緩沖液800 μL，顛倒離心5 min，使葉片粉末與提取液充分混合。（2）將混合液置于65 ℃的水浴中加熱1 h，每隔15 min搖動1次。（3）將混合液放入冰盒至常溫，加入800 μL酚 ∶ 氯仿 ∶ 異戊醇（25 ∶ 24 ∶ 1），輕輕晃動5 min。（4）4 ℃，11 000 r/min離心15 min，轉移上清液于另一滅菌離心管中。加入750 μL氯仿 ∶ 異戊醇（24 ∶ 1），輕輕晃動5 min。（5）4 ℃，11 000 r/min離心10 min，轉移上清液于另一滅菌管中，加入等體積-20 ℃預冷的異戊醇，輕輕晃動5 min，-20 ℃冰箱放置1 h。（6）4 ℃，11 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入4 ℃預冷的70%乙醇500 μL，洗滌沉淀2次。將離心管置于吸水紙上，室溫風干20 min。（7）加入100 μL TE緩沖液溶解沉淀、加入1 μL的RNAseA（10 mg/L），4 ℃保存待測。

1.2.2 ISSR引物篩選 ISSR所用引物為加拿大哥倫比亞大學（UBC）公布的100個引物序列，由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。 用 A42（廣東）、A48（海南）、A49（廣西）3份材料作為DNA模板從中篩選出22條擴增條帶清晰、多態性好的引物用于擴增反應。

用A48作為DNA模板對引物進行退火溫度的PCR擴增，退火溫度設為47～57 ℃，PCR儀自動生成12個退火溫度（47.0、47.7、48.5、49.3、50.4、51.4、52.5、53.6、54.7、55.6、56.5、57.1 ℃），1%瓊脂糖凝膠中電泳，電壓120 V，電泳50 min，篩選出每個引物合適的退火溫度。

1.2.3 ISSR擴增反應體系 ISSR擴增反應體系經過優化后確定為20 μL，反應體系如下：模板（100 ng/μL）1.0 μL、Taq酶（5.0 U/μL）0.5 μL、10×buffer 2.0 μL、ISSR引物（10 μmol/L）1.0 μL、dNTP（10 mmol/L）1.4 μL、MgCl2（25 mmol/L）2.0 μL、無菌水補足至20 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性7 min；94 ℃變性30 s，47～57 ℃（按不同的引物退火溫度調整）退火45 s，72 ℃延伸2 min，45個循環；72 ℃延伸7 min。PCR產物在含有TBE的1%瓊脂糖凝膠中電泳，電壓120 V，電泳50 min。以2 000 bp Maker為標準分子量對照，在Gene Genius Bioimaging System凝膠成像儀上照相。

1.2.4 數據統計 ISSR為顯性標記，圖譜中的每一條帶都視為1個分子標記。對ISSR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，記錄擴增條帶的有無，在電泳圖上，有清晰條帶的記為 1，同一位置無帶的記為 0，根據統計條帶的結果建立原始數據（0，1）矩陣。利用NTSYS-pc 2.1軟件，計算品種的遺傳相似系數，用UPGMA法進行聚類分析，繪制樹狀聚類圖。

2 結果與分析

2.1 ISSR擴增產物多態性分析

從UBC公布的100條引物中篩選出22條能產生清晰條帶、重復性好的ISSR引物對52份種質進行擴增，共產生127條大小約在100～2 500 bp的條帶（表2）。圖1顯示引物UBC 843對割手密部分材料的擴增結果。22個引物擴增的條帶變化為8條（UBC853和UBC892）到4條（UBC854和UBC855），平均每個引物能擴增5.8條條帶，多態性條帶平均5.5條。在擴增出的127個條帶中，其中121條具有多態性，多態百分率（PPL）為95.3%，表明割手密種質資源中具有豐富的遺傳多態性，運用ISSR標記可以很好地揭示參試割手密種間或種內的遺傳差異及親緣關系。

2.2 ISSR標記的遺傳相似性分析

利用NTSYS 軟件計算52份割手密材料間的Nei-Li相似系數GS，52份割手密的遺傳相似系數在0.60～0.91之間，平均GS為0.73。從種質的遺傳相似系數可以看出（表3），在52份割手密材料中，A41和A16的遺傳相似系數最小（0.60），表明 A41和A16的親緣關系甚遠，遺傳差異較大，存在較大的遺傳多樣性。A26和A13的遺傳相似系數最大（0.91），表明A26和A13的親緣關系較近，遺傳差異較小。從割手密遺傳相似性分析可知，野外采集的52份野生割手密存在較大的遺傳多樣性和種內遺傳相似性。結果再次表明，這52份割手密種質存在豐富的遺傳多樣性。

2.3 ISSR標記的聚類分析

利用NTSYS-pc 2.1軟件，計算材料間的遺傳相似系數，通過UPGMA法進行聚類分析（圖2）。在遺傳相似系數0.72時可分為四大類。第Ⅰ類包括26份種質，是最大的一個類群，其中6份來自云南，5份來自廣東，7份來自廣西，7份來自海南，1份來自福建。其中A51和A52遺傳相似系數為0.90，說明它們的親緣關系很近。第Ⅱ類包括23份種質，其中8份來自海南。第Ⅲ類只包括A24（廣西）1個材料。第Ⅳ類包括A15（貴州）和A16（江西）2份種質。在遺傳相似系數0.735時可將第Ⅰ類分為兩個亞類。第一亞類包括云南的A1和A9，廣東的A3、A10和A12，海南的A7、A8、A13、A14和A18，以及廣西的A11和福建的A6。第二亞類包括云南的A4、A5、A22和A19，廣西的A17、A20、A21、A49、A50和A51，海南的A47和A48，廣東的A2和A52。從圖2可見它們之間的遺傳聚類與其地理來源沒有嚴格的一致性。

3 討論與結論

3.1 ISSR標記

劉洪博等[14]用SSR分析云南割手密的遺傳多樣性，共擴增出233條條帶，多態性比率為89.0%。王英等[15]采用ISSR分子標記技術對96份甘蔗種質資源的遺傳多樣性進行了分析，利用7條多態性較強的引物共擴增出85條多態性條帶，其種質的遺傳相似系數在0.15～0.19之間。本實驗首次采用ISSR對我國南方地區的割手密種質資源的遺傳多樣性進行分析，在擴增出的127個條帶中，其中121條具有多態性，多態百分率（PPL）為95.3%，遺傳相似系數在0.60～0.91之間，平均GS為0.73。綜上所述，本實驗的割手密的ISSR標記表現出了較高的多態性（95.3%），表明割手密種質資源具有豐富的遺傳多態性，在分子水平上差異較大。本試驗與以上研究結果略有差別，有差別的原因可能是研究材料和研究方法的不同造成的[16]。Prevost A只用了4個ISSR引物就將安第斯亞種的34個馬鈴薯品種分開了[17]。劉莉等[18]從50條ISSR引物中選出的7條引物均能擴增出清晰條帶，并將20份野牛草單株區分開。本試驗利用22條ISSR引物能夠將52份割手密材料分開，并利用UPGMA法進行聚類將供試材料劃分為六大類。再次證實了ISSR標記技術在割手密遺傳多樣性分析中是一種效率高、重復性好的分子標記技術，適合割手密種質遺傳多樣性的研究，這與王英等得出ISSR分子標記技術用于甘蔗屬遺傳多樣性的分析是可行的結論一致[15]。

3.2 聚類分析

從供試材料間的聚類分析可以看出，52份割手密的遺傳聚類與其地理來源沒有嚴格的一致性，產生這種現象的原因可能有兩個：一是地區之間存在種質資源的交換，二是不同地方品種來源地的小生境可能存在一定的遺傳相似性。特別值得注意的是，A23（福建）與其它供試材料差異明顯，單獨為一類。與同為福建的A28并沒有聚為一類，其原因可能是地理位置導致了基因的變異，A23靠海邊，A28靠近山區。

本研究用ISSR分子標記技術對52份割手密材料進行遺傳多樣性分析，從分子水平上驗證了這些割手密的分類，明確了它們之間的遺傳相似性。采集的52份割手密的遺傳多樣性不僅豐富而且其遺傳關系與地理來源無嚴格一致性。因此，應加強割手密種質資源的原生境和異地保護力度，以及加大選育優良割手密的進度，為割手密種質資源的保護鑒定和甘蔗的育種、能源草的選育做好準備。

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責任編輯：沈德發