胡椒資源ISSR遺傳多樣性研究

范睿等

摘 要 利用簡單重復序列區間（ISSR）技術分析來自不同國家的56份胡椒種質資源的遺傳多態性。結果顯示：7條引物共產生141條清晰的譜帶，分子量在0.2～3.0 bp之間，多態位點百分率達100%，在一定程度上說明胡椒資源遺傳的復雜性和多樣性。在相似性系數約為0.51的水平上將56份資源聚為3個類群，與基于ITS的研究結果類似。大胡椒與其它種質的親緣關系均比較遠，顯示出其明顯的差異性和獨特性，與其形態學分類結果一致，同時支持將頂花胡椒、光軸苧葉蒟歸入苧葉蒟，光莖胡椒作為一個變種。

關鍵詞 胡椒；種質資源；ISSR標記；遺傳多樣性

中圖分類號 S573.9 文獻標識碼 A

Genetic Diversity of Pepper Germplasm

Resources by ISSR Markers

FAN Rui， WU Huasong*， HAO Chaoyun， TAN Lehe， WU Gang， YANG Jianfeng

Spice and Beverage Research Institute， CATAS / Ministry of Agriculture Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops / Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulatioin for Tropical Spice and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China

Abstract To assess the genetic diversity of pepper germplasm resources and some taxonomic problems of Piper genus， 56 accessions were analyzed using inter-simple sequence repeat（ISSR）markers. 7 primers were screened from 100 random primers， and a total of 141 fragments were amplified ranging from 0.2～3.0 kb， all of which were polymorphic. The average number of DNA band produced by each primer was 20.1. Based on the dendrogram of UPGMA， 56 accessions could be divided into three groups at the level of 0.51， which was similar to the results of Jaramillo et al. obtained from the studies on ITS sequences. The location of P. umbellatum in the dendrogram showed that it had high level of genetic distance to other accessions， which was similar to the results of morphology and floristic geography. The high degree of correlation among P. boehmeriifolium， P. boehmeriifolium var. tonkinense， P. terminaliflorum and P. glabricaule supported well former researches， and it was reasonable to combine the first three speices into one taxon（P. boehmeriifolium）， and alter Piper glabricaule as a variety. And the phylogenetic relationships of some other species were also discussed.

Key words Pepper（Piper nigrum）； Germplasm resources； ISSR marker； Genetic diversity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.016

胡椒（Piper nigrum）為胡椒科（Piperaceae）胡椒屬（Piper）多年生木質藤本植物，素有“香料之王”的美譽，既是世界最重要的香辛作物之一，又具有藥用價值和工業利用價值，在醫學領域可被用作健胃劑、解熱劑和支氣管粘膜刺激劑等[1-2]，在食品工業上也可用作抗氧化劑、防腐劑和保鮮劑等[3]。據聯合國糧食及農業組織統計，2008年世界胡椒收獲面積5.53×105 hm2，總產量4.33×105 t，其中中國胡椒主要分布在海南、云南、廣東、廣西和福建等地，年產量達2.72×104 t，位居世界第五[4]。作物種質資源包括野生近緣種、地方品種、選育品種、育種品系和遺傳材料等，蘊藏著各種性狀的遺傳基因，是品種選育和生物學理論研究的基本材料來源[5]。胡椒野生近緣種資源極為豐富，有超過1 000個植物種類，為胡椒科重要的泛熱帶組成成分[6-7]，但許多種類外形特征極為相似，給種類準確鑒定造成了困難[8-9]。胡椒地方品種、選育品種和育種品系等資源也較為豐富，地方品種如卡納瓦利、巴蘭哥塔等，各國選育品種如興熱1號、云選1號、班尼約爾、Nedumchola、Vadakkan、73-F-5等，品種遺傳背景復雜[10-11]。胡椒種質資源物種多樣和形態相似的特點影響了其準確分類鑒定，不利于后續的資源評價與創新利用工作。借助分子技術是解決分類問題最為可靠而快捷的方法。Pradeepkumar等[12]利用RAPD（Random amplified polymorphic DNA）標記研究了22個胡椒種質的指紋圖譜，發現除了班尼約爾-3外，其余種質均擴增得到了特異性譜帶；Keshavachandran等[13]也用RAPD研究了17個胡椒品種和12個蓽菝品種的指紋圖譜，所有種質均可獲得特異性譜帶，表明該標記可以用于胡椒種質的鑒別。姜艷等[14]開展海南省不同采集地胡椒種質的ISSR遺傳多樣性分析，但主要是中國海南省內的幾個種，種類較少。本研究利用簡單重復序列區間（Inter-simple sequence repeat，ISSR）分子標記技術，對來自中國、印度尼西亞、印度、巴西、伯利茲等國家或地區的56份野生近緣種、栽培品種和育種材料進行遺傳多樣性分析，旨在揭示其親緣關系，為種質的準確鑒定提供可靠依據，并解決一些種質分類疑問，對今后遺傳改良、育種親本選配、種質保護和核心種質構建等具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

野生近緣種、主栽品種和育種材料共56份，分別引種自東南亞和中南美洲部分國家或地區，其中國內野生近緣種30種，國外野生近緣種9種，主栽品種和育種材料等17份，活體保存于農業部萬寧胡椒種質資源圃。詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取 取植物嫩葉樣品約100 mg，利用基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取總DNA。UV-2102型紫外可見分光光度計測定濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA是否降解，濃度稀釋為50 ng/μL，備用。

1.2.2 PCR擴增 經不同反應條件擴增對比分析，建立最佳ISSR反應體系及程序[15]。25 uL反應體系：含1×PCR buffer，2 mmol/L Mg2+，200 μmol/L dNTPs，2 μmol/L引物，100 ng模板，1 U Taq DNA聚合酶。反應程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 120 s，復性（據不同引物的退火溫度）60 s，72 ℃ 3 min，35個循環；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。PCR產物均用含有DuGreen的1.5%瓊脂糖凝膠在1×TBE中電泳，上樣量 5 μL，電壓4 V/cm。電泳結束后在凝膠成像系統上檢測拍照。

1.3 數據分析

將擴增片段作為顯性標記，按照有（1）和無（0）記錄電泳譜帶，構建原始數據矩陣。應用PopGen32軟件包計算Shannon多樣性指數、Nei's無偏遺傳距離?；贜ei's多樣性指數矩陣，采用無權重配對算術平均數法（Unweighted pair group method with arithmatic mean，UPGMA）構建系統關系樹，基于ISSR表型數據矩陣進行主成分分析（Principal component analysis，PCA）。

2 結果與分析

2.1 擴增產物多態性

從100條ISSR引物中篩選出擴增條帶清晰、重復性高的引物7條，對所有樣品進行多樣性分析。結果顯示，7條引物共檢測到141個位點，每個引物檢測位點數在10～26個之間，平均為20.1個，DNA片段大小分布在0.2～3.0 kb之間（圖1），反應中所用引物序列大多富含（GT）n或（TG）n、（AG）n或（GA）n和（AC）n等二核苷酸重復序列（表2），所有條帶均具有多態性，多態位點比例達100%。Shannon多樣性指數評價樣品遺傳多樣性結果表明：平均多樣性指數（I）為0.560 1，每個位點的有效等位基因數（Ne）為0.379 9（表2）?？梢?，上述胡椒種質資源的多態性條帶極為豐富，在一定程度上說明其遺傳背景的復雜性和遺傳多樣性的豐富性。

2.2 遺傳相似性系數分析

根據條帶矩陣計算Nei's遺傳相似性指數，按照UPGMA法生成表征種質間親緣關系的樹狀聚類圖（圖2）。由7條引物擴增帶計算得到的56份胡椒種質資源的Nei's遺傳相似性指數在0.305～0.933之間變動，平均值為0.574，其中大胡椒（DHJ）與班293（B293）之間的相似性系數最小（0.305），雜交種質柬印43（JY43）與柬印93（JY93）之間最高（0.933）。聚類結果表明，在相似性系數約為0.51水平上可將56份樣品聚為3個類群：（1）原產亞洲的胡椒野生近緣種資源，以及栽培品種和育種材料；（2）原產美洲的野生近緣種；（3）廣泛分布于東南亞、美洲和非洲的大胡椒?？梢姡诖蟮牡乩矸秶鷥龋焚Y源遺傳親緣關系與地理距離存在一定的相關性。

主成分分析可排除重疊和分類意義不大的條帶，使重要因素突顯出來。特征根大小代表各綜合指標對總遺傳方差貢獻的大小，特征向量表示各性狀對綜合指標貢獻的大小。由表3和圖3可見，第1主成分所占信息量僅21.91%，前3個主成分累積貢獻率僅有37.58%，直到第8個主成分累積貢獻率才達到54.45%，各性狀貢獻率分散，累積貢獻率增長不明顯，說明胡椒資源在形成演化過程中基因變異的多方向性和復雜性。

3 討論與結論

遺傳多樣性是生物所攜帶遺傳信息的總和，代表該物種在特定環境中基因的豐富程度，是植物選育及研究中最重要與最有價值的物質基礎。本研究顯示，胡椒種質資源平均Nei's相似性指數僅為0.574，遺傳多樣性水平極高，遺傳變異明顯，與以往的研究結果基本一致。如Pradeepkumar等[16]和施江等[17]分別利用RAPD和AFLP標記技術對胡椒栽培種與野生近緣種的遺傳關系進行了研究，其中多態位點百分率均高達98%以上，遺傳多樣性水平極高。對胡椒種質資源遺傳多樣性極高的現象，分析認為，胡椒屬植物多為木質藤本植物，壽命長、雌雄異株、風媒傳粉，后代極易產生基因變異，因此其高水平的遺傳多樣性也不難理解。同時，主成分分析的累計貢獻率增長不明顯，貢獻率分散，說明本類群在演化過程中遺傳變異的無規律性，與基于形態表型特征的研究結果基本一致[9]。

作物種質資源包括野生近緣種、地方品種、選育品種、育種品系和遺傳材料等，是優異品種篩選和培育的重要性狀材料來源，被認為是最有價值和戰略意義的物質財富而受到越來越多的重視。目前，關于胡椒野生近緣種遺傳多樣性與分子系統學已開展了部分研究。由本研究可見，56份胡椒種質可聚為3大分支，亞洲熱帶進化支、美洲熱帶進化支以及泛熱帶分布的大胡椒進化支，與以往研究基本一致。基于核糖體DNA（nrDNA）ITS（Internal transcribed spacers，ITS）序列，發現世界范圍內胡椒屬植物可形成了三大分支：亞洲熱帶進化支、美洲熱帶進化支和南太平洋島嶼進化支，表明胡椒屬植物親緣關系與其地理距離存在相關性[18]。Parthasarathy等[19]應用GIS和聚類分析多樣性，結果發現親緣關系較近的種類常出現在相同或鄰近地區，表明在小的區域范圍內，該植物類群親緣關系與地理距離呈較強的正相關。但在亞洲熱帶進化支內，地理距離較遠的種類反而具有較近的親緣關系，物種相似性并未表現出地域性特征，與以往研究結果存在一定差異，具體原因還有待開展分子系統學等方面的工作。

大胡椒穗狀花序多數、通常2-7復作傘形花序式排列，與胡椒屬其他物種差異明顯，被Willdenow等植物學家列入大胡椒屬（Pothomorphe）[20]，而主張大種概念的林奈則將其歸入胡椒屬。從本文結果看，大胡椒與其他胡椒種質親緣關系較遠，單獨聚為一個分支，表現出明顯的差異性和獨特性。1982版《中國植物志》將苧葉蒟（P. boehmeriaefolium）、頂花胡椒（P. terminaliflorum）、光莖胡椒（P. glabricaule）作為3個物種區別對待，而光軸苧葉蒟（P. boehmeriaefolium var. tonkinense）作為1個變種，后來Gilbert和夏念和[21]等建議將頂花胡椒、光軸苧葉蒟歸入苧葉蒟，而光莖胡椒作為變種（P. boehmeriifolium var. glabricaule）?；诒疚腎SSR標記的聚類結果可見，上述4個種質作為1個小分支聚在一起，其中光軸苧葉蒟與苧葉蒟的Nei's相似性水平達0.843，表現出較近的親緣關系，支持最新分類結果。球穗胡椒為中國西南部常見種，以葉具暗紅色腺體、葉背灰白色、果序短為特征，而腺脈蒟Piper bavinum通常有更長果序和缺少粉白色被毛而與球穗胡椒區別，但后來發現這些差別呈連續性，因此將它們作為一個類群[21]。由本研究結果可知，采自云南的球穗胡椒與采自海南的腺脈蒟在相似性0.741水平上聚在一起，相對于其他物種表現出更近的親緣關系，但是否能否歸入一個類群有待深入研究。

參考文獻

[1] Boff M I C， Sartoari D V， Bogo A. Effect of extracts of Piper nigrum L. on the bean weevil， Acanthoscelides obtectus（Say）[J]. Revista Brasileria de Armazenamentho， 2006， 31： 17-22.

[2] Scott I M， Jensen H R， Philogene B J R， et al. A review of Piper spp.（Piperaceae）phytochemistry， insecticidal activity and mode of action[J]. Phytochem Rev， 2008， 7： 65-75.

[3] 徐 燕， 劉德清. 胡椒中天然防腐劑的提取方法及其抑菌作用研究[J]. 中國調味品， 2007（7）： 57-60.

[4] The Food and Agriculture Organization of the United Nations[EB/OL]. http： //faostat.fao.org/site/567/default. aspx#a ncor， 2009.

[5] Upadhyaya H D， Gowda C L L， Buhariwalla H K， et al. Efficient use of crop germplasm resources： identifying useful germplasm for crop improvement through core and mini-core collections and molecular marker approaches[J]. Plant Genetic Resources： Characterization and Utilization， 2006， 4（01）： 25-35.

[6] Soltis PA， Soltis D E， Chase M W. Angiosperm phylogeny inferred from multiple genes as a tool for comparative biology[J]. Nature， 1999， 402： 402-404.

[7] Frodin D G. History and concepts of big plant genera[J]. Taxon， 2004， 53： 753-776.

[8] Dyer L A， Palmer A D N. Piper： a model genus for studies of phytochemistry， ecology， and evolution[M]. Plenum Publishers： Kluwer Academic， 2004.

[9] 郝朝運， 譚樂和， 范 睿， 等. 中國部分胡椒屬植物表型性狀的數量分類[J]. 熱帶作物學報， 2012， 33（5）： 779-785.

[10] Pradeepkumar T， Karihaloo J L， Archak S. Molecular characterization of Piper nigrum L. cultivars using RAPD markers[J]. Current Science， 2001， 81（3）： 246-248.

[11] 鄭維全. 海南胡椒雜交種質主要農藝性狀觀察[J]. 廣西熱帶農業， 2006， 10（5）： 33-34.

[12] Pradeepkumar T， Karihaloo J L， Archak S. Molecular characterization of Piper nigrum L. cultivars using RAPD markers[J]. Current Science， 2001， 81（3）： 246-248.

[13] Keshavachandran R， Nazeem PA， Karihaloo J L. Genetic fingerprinting of Piper nigrum L. and Piper longum L. cultivars using RAPD markers[J]. Recent Trends in Horticultural Biotechnology， 2007， 98： 635-640.

[14] Jiang Y， Liu J P. Analysis of genetic diversity of Piper spp. in Hainan Island（China）using inter-simple sequence repeat ISSR markers[J]. African Journal of Biotechnology， 2011， 10（66）： 14 731-14 737.

[15] 范 睿， 郝朝運， 譚樂和， 等. 胡椒ISSR-PCR反應體系的建立及優化[J]. 熱帶農業科學， 2012， 33（6）： 25-30.

[16] Pradeepkumar T， Karihaloo J L， Sunil A， et al. Analysis of genetic diversity in Piper nigrum L. using RAPD markers[J]. Genetic Resources and Crop Evolution， 2003， 50（5）： 469-475.

[17] 施 江， 辛 莉， 楊 彥， 等. 卡瓦胡椒及胡椒的熒光AFLP分子標記研究[J]. 河南農業科學， 2007， 7： 80-83.

[18] Jaramillo M A， Manos P S. Phylogeny and patterns of floral diversity in the genus Piper（Piperaceae）[J]. American Journal of Botany， 2001， 88（4）： 706-716.

[19] Parthasarathy U， Saji K V， Jayarajan K， et al. Biodiversity of Piper in South India-application of GIS and cluster analysis[J]. Current Science， 2006， 91（5）： 652-658.

[20] 中國植物志編輯委員會， 中國植物志[M]. 北京： 科學出版社， 1982： 14-70.

[21] Gilbert M， Xia N H. Notes on the Piperaceae of China[J]. Novon， 1999， 9（2）： 190-198.

責任編輯：趙軍明