文心蘭2種主要病毒的快速檢測及其組培脫毒方法

劉福秀等

摘 要 利用感染了建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒的文心蘭葉片，建立同步檢測文心蘭2種病毒的雙重RT-PCR方法，該方法可一次性擴增出2種病毒的DNA條帶，最低可檢測到相當于1 μg的帶毒葉片。同時采用花梗組織培養脫毒并結合培養基添加病毒A的脫毒方法，對感染2種病毒的文心蘭進行外植體脫毒試驗，獲得文心蘭組培苗脫毒方法。用建立的雙重RT-PCR檢測脫毒效果，脫毒率為75.3%。

關鍵詞 建蘭花葉病毒（CymMV）；齒蘭環斑病毒（ORSV）；RT-PCR；文心蘭；脫毒

中圖分類號 S682.31 文獻標識碼 A

Rapid Detection of 2 Main Viruses in Oncidium and the Method

of Virus Elimination by Plant Tissue Culture

LIU Fuxiu， WANG Anshi， HAN Yuchun， LIN Mingguang*

Hainan Entry & Exit Inspection and Quarantine Bureau， Haikou， Hainan 570311， China

Abstract A duplex RT-PCR method was developed for rapid detection of Oncidium infected 2 important virus， Cymbidium mosaic virus（CymMV）and Odontolossum ring spot virus（ORSV）， in one step. It could detect the virus as low as 1 μg leaf tissue. And a method of virus elimination by plant tissue culture was developed. It combined with lateral mud tissue culture and an anti-virus reagent， virus A， and verified the effect of virus-free by duplex RT-PCR. The results showed that the virus-free rates of this lateral bud culture were 75.3%.

Key words Cymbidium mosaic virus； Odontolossum ring spot virus； RT-PCR； Oncidium； Virus elimination

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.025

文心蘭（Oncidium）又名跳舞蘭、舞女蘭、金蝶蘭、瘤瓣蘭等，系蘭科文心蘭屬植物的總稱，屬于熱帶復莖性著生蘭，原產于西印度群島、墨西哥、巴西等地[1-3]。以其花姿優美、花色亮麗搶眼，甚具喜氣，在西洋插花或是節慶活動上常被廣泛應用。隨著市場需求量的增大，文心蘭得到大量推廣種植，種苗主要通過組培快繁獲得。但在生長過程中易受到多種病毒的危害，嚴重影響其產量和品質，其中以建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）和齒蘭環斑病毒（Odontolossum ring spot virus，ORSV）發生最為普遍，且這兩種病毒通常在文心蘭上復合感染，造成更為嚴重的危害[4-7]。目前對病毒病害的防治主要采用莖尖組織培養結合熱處理技術[1，8-9]，但有關文心蘭脫毒處理卻少有報道，雖然朱根發等[10]早在1997年就有了關于“文心蘭脫毒快繁技術研究”的報道，并且通過ELISA法對脫毒后樣品中包括CymMV和ORSV在內的4種病毒進行了檢測，但作者研究所使用的材料未經過病毒檢測，整個脫毒過程也沒有專門的病毒抑制步驟和污染控制方法，只在檢測誘導出的文心蘭原球莖時均未發現病毒。

為增強我國文心蘭產業的國際競爭力，本研究采用不同的脫毒方法，對感染CymMV和ORSV的文心蘭種苗進行外植體脫毒試驗，探索出文心蘭脫毒處理的適宜方法，并獲得文心蘭完全脫毒苗。

多重PCR方法可以通過1次試驗同時檢測2種或2種以上的病毒，如Kuroda等[11]建立了可同時檢測黃瓜花葉病毒（CMV）、蠶豆萎蔫病毒（BBWV-2）和三葉草黃脈病毒（ClYVV）的多重RT-PCR技術；Ito等[12]建立了可檢測柑橘裂皮類病毒（CEVd）等6種病毒的多重RT-PCR技術，Xie等[13]建立了一步法RT-PCR同時檢測4種甘蔗病毒的方法。本研究建立了文心蘭兩種主要病毒的雙重RT-PCR檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

帶毒和健康供試文心蘭均采自海南文昌市熱帶植物隔離檢疫農場的文心蘭鮮切花品種圃。DAS-ELISA所用的堿性磷酸酶標記的CymMV和ORSV檢測試劑盒，購自ADGEN公司。RNA提取試劑盒和RT-PCR試劑購自大連TaKaRa公司。20%病毒A可濕性粉劑購自安徽淮南山河藥業有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據GenBank公布的CymMV的外殼蛋白（coat protein，CP）基因和ORSV CP 基因的保守序列，分別設計RT-PCR的2對特異性引物，由上海Sangon公司合成。引物信息見表1。

1.2.2 酶聯免疫吸附法（DAS-ELISA） 稱取100 mg樣品葉片，加磷酸緩沖液充分研磨，將研磨所得汁液于3 000 r/min離心5 min，取病汁液上清進行雙抗體夾心（DAS-ELISA）檢測。以DAS-ELISA和RT-PCR結果均為陽性的樣品為陽性樣品，均為陰性的樣品為陰性樣品進行組織培養。

1.2.3 雙重RT-PCR方法及特異性試驗 將100 mg DAS-ELISA檢測CymMV和ORSV均為陽性的樣品葉片用液氮研磨后，利用RNA提取試劑盒提取總RNA。以提取的RNA為模板進行反轉錄。

反轉錄體系20 μL，10 mmoL/L dNTPs 1 μL、20 μmoL/L CyR引物1.5 μL、20 μmoL/L OR引物1.5 μL、RNA模板1 μL，70 ℃反應5 min，冰上放置5 min，加入AMV酶5倍緩沖液4 μL、200 U/μL AMV RT（反轉錄酶）1 μL、40 U/μL RNA酶抑制劑1 μL，加DEPC-H2O補足20 μL，單一病毒檢測時引物改為2.0 μL，其余不變，42 ℃反應1 h。

PCR反應體系20 μL，上述反轉錄產物2 μL、10倍PCR緩沖液（含Mg2+） 2 μL、10 mmoL/L dNTPs 0.6 μL、4條引物各0.5 μL、2 U/μL Taq DNA聚合酶1 μL，滅菌ddH2O補足20 μL，單一病毒檢測時只加其中一對引物。于PCR儀（Veriti 96 Well Thermal Cycler，Applied Biosystems）上進行擴增，反應程序為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min 20 s，30個循環；72 ℃ 7 min。

擴增結束后取15 μL PCR產物進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，并用Syngene GBOX CHEMI XR5凝膠成像系統記錄結果。

1.2.4 克隆與測序 PCR產物電泳后分別割膠回收，依次克隆到pMD18-T載體（TaKaRa）上，酶切鑒定陽性克隆后，送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序。每個產物至少測3個克隆，每個克隆都進行正反向測序。

1.2.5 檢測靈敏度的確定 提取得到的植物總RNA最后溶于30 μL DEPC處理ddH2O。將所得植物總RNA按10倍梯度依次稀釋，按上述方法進行cDNA合成和PCR擴增，取15 μL進行電泳分析。

1.2.6 脫毒 按照王安石等[14]通過組織培養的方法獲得增殖至第3代的組培苗，從繼代第4次時開始在培養基中分別添加0、5、10、15 mg/L病毒A，連續添加3代。病毒A使用前經滅菌的0.22 μm細菌過濾器過濾。用DAS-ELISA和RT-PCR檢測第6代組培苗的脫毒效果并統計原球莖的誘導與增殖情況。

2 結果與分析

2.1 雙重RT-PCR檢測

用雙重PCR體系分別檢測單獨感染CymMV、ORSV以及復合感染兩種病毒的樣品，RT-PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，結果單獨感染CymMV的樣品獲得1條大小約670 bp DNA擴增片段，結果單獨感染ORSV的樣品獲得1條大小約520 bp DNA擴增片段，復合感染兩種病毒的樣品同時獲得670 bp和520 bp兩條DNA擴增片段，均與預期結果一致，而健康植株和清水對照都沒有擴增片段出現（圖1）。克隆測序后在GenBank中BLAST檢索，結果675 bp較大片段的序列與GenBank中已發布的CymMV相應序列一致性達95%以上。524 bp較小片段的序列與GenBank中已發布的ORSV相應序列的序列一致性達96%以上。表明擴增的片斷分別來自CymMV和ORSV，即該方法能準確檢測出這兩種病毒。

2.2 靈敏度檢測結果

將所得植物總RNA按10倍梯度依次稀釋后進行RT-PCR，均能擴增出清晰的條帶。CymMV單重RT-PCR檢測時稀釋106倍后仍能擴增出條帶；ORSV單重RT-PCR檢測時稀釋105倍后仍能擴增出條帶，但稀釋106倍后擴增不出明顯的條帶；而雙重RT-PCR檢測時只能擴增出稀釋104倍目的條帶，稀釋105倍后不能擴增出條帶（圖2）。因此，可以用本研究方法檢測文心蘭中的CymMV和ORSV，且檢測靈敏度至少能達到105倍，雖比單重RT-PCR檢測靈敏度稍低，但比DAS-ELISA檢測靈敏度（數據未公布）至少高103倍。

2.3 病毒A對組培苗生長的影響

以健康蘭株花梗為外殖體，進行組培擴繁，不同濃度的病毒A對原球莖誘導與增殖的影響見表2。從表2可以看出，病毒A濃度在10 mg/L以下時對原球莖誘導與增殖影響與不添加病毒A時差異不明顯，但當病毒A的濃度增加到15 mg/L時，開始出現生長抵制現象。

2.4 病毒A對脫毒效果的影響

在增殖培養基中分別添加0、5、10、15 mg/L病毒A，選取分別攜帶CymMV、ORSV及兩種病毒復合感染的蘭株花梗為外植體進行組培脫毒處理，帶毒情況用DAS-ELISA和RT-PCR檢測，兩種結果均為陽性的蘭株花梗為陽性樣品，以健康蘭株花梗為陰性樣品。于煉苗結束后移栽前隨機抽取96株小苗，同樣用DAS-ELISA和RT-PCR檢測小苗帶病毒率。結果所有陰性樣品兩種檢測方法均未檢測到病毒，且使用病毒A處理的脫毒率明顯高于不使用病毒A處理。隨著病毒A濃度的增高，脫毒率隨之升高。病毒A濃度為5 mg/L時，脫毒效果不理想，DAS-ELISA也能檢測到病毒，雙重RT-PCR檢測的脫毒率有時不足50%。但病毒A濃度達到10 mg/L及以上時，所有陽性樣品組培苗用DAS-ELISA均未檢測到病毒，雙重RT-PCR檢測的脫毒率均達70%以上，且復合感染樣品檢測時兩種病毒均同時出現。結果見表3。

3 討論與結論

近年來應用RT-PCR技術建立了多種蘭花病毒快速檢測方法，并通過不斷優化檢測程序來提高檢測特異性、縮短檢測時間、提高檢測效率。但是這些方法均是針對單一病毒進行檢測。為了降低檢測成本、縮短病毒檢測時間，周國輝等[15]、鄭國華等[16]、曾燕君等[17]先后建立了雙重RT-PCR同時檢測2種蘭花病毒的方法，有效地解決了這一問題，并利用該方法對田間蘭花進行了病毒檢測。但均沒有對檢測方法的穩定性和靈敏度進行評估，本研究建立的檢測方法在綜合前人方法的基礎上開發出了一套新的檢測引物，實現了更好的擴增，提高了檢測穩定性和靈敏度（圖1），且檢測靈敏度很高，稀釋105倍后仍能擴增出條帶（圖2）。

有關文心蘭組織快繁技術的報道很多[10，14，18]，但文心蘭脫毒處理方面的研究少有報道。朱根發等[10]報道的在檢測誘導出的文心蘭原球莖時均未發現病毒的原因可能是所選擇的實驗材料本身就是不攜帶病毒的，其研究內容主要是組培技術，少有脫毒技術。病毒病是制約文心蘭產業發展的一個重要因素，本研究首次在文心蘭脫毒種苗的生產中加入病毒A。組織培養至確定獲得無菌苗的第3代組培苗后，從繼代第4次時開始在培養基中分別添加0、5、10、15 mg/L病毒A，病毒A使用前經滅菌的0.22 μm細菌過濾器過濾。隨著病毒A添加濃度的提高和轉接代數的增加，脫毒率不斷提高，但組培苗的枯死率也相對的增加（數據未顯示），不宜多代添加。本研究連續添加3代。用DAS-ELISA和RT-PCR檢測第6代組培苗的脫毒效果并統計原球莖的誘導與增殖情況。結果表明，病毒A濃度達到10 mg/L及以上時，所有陽性樣品組培苗用DAS-ELISA均未檢測到病毒，雙重RT-PCR檢測的脫毒率均達70%以上，且復合感染樣品檢測時兩種病毒均同時出現（表3）。但病毒A濃度達到15 mg/L時，增殖生長情況會受到一定程度的抑制（表2），表明高濃度的病毒A不利于文心蘭組培苗的增殖。筆者推薦病毒A的使用濃度為10 mg/L，在此基礎上結合病毒檢測技術，能有效生產出無毒文心蘭種苗。

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責任編輯：沈德發