新生大鼠海馬神經干細胞的培養與傳代

作者簡介：沈棟林（1973、3-） 男 ，碩士，副主任醫師，研究方向：兒童神經系統疾病；李同歡，男，主治醫師，遵義醫學院附屬醫院；

通訊作者：束曉梅，女，教授，遵義醫學院附屬醫院

摘要：

目的：探討新生大鼠海馬神經干細胞（Neural Stem Cells， NSCs）體外分離培養的條件和傳代的新方法。方法：從新生大鼠海馬中分離神經干細胞，采用無血清培養技術，在表皮生長因子（epidermal growth factor， EGF）、堿性成纖維生長因子（ basic fibroblast growth factor， bFGF）和B27聯合作用下使其不斷增殖克隆，采用神經小球分離試劑盒進行傳代，利用免疫熒光染色的方法對培養的細胞進行鑒定。結果：從新生大鼠海馬分離的細胞群可不斷增殖形成細胞克隆球，并能穩定傳代，呈nestin陽性表達，且具有多向分化能力。采用神經小球分離試劑盒傳代的細胞球生長快，數量多，體積大，折光性好。結論：利用無血清技術和特定生長因子，可以使來源于新生大鼠海馬的NSCs在體外擴增，利用大鼠神經小球分離試劑盒可以有效地進行傳代，穩定高效地培養出NSCs。

關鍵詞：NSCs；分離培養；傳代

【中圖分類號】

R329.2+8 【文獻標識碼】A 【文章編號】1002-3763（2014）06-0024-01

目前越來越多的實驗表明，NSCs在治療難治性癲癇、顱腦外傷、腦腫瘤、阿爾茨海默病等方面，發揮了重要作用[1-2]。簡潔高效地獲得NSCs，將更好地為實驗基礎研究及臨床應用奠定良好的基礎。我們從新生大鼠海馬中分離NSCs，在體外進行培養、傳代和分化，為進一步利用NSCs進行科學研究提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 材料和試劑： 0～1 d的新生Wistar大鼠，由遵義醫學院動物實驗中心提供。DMEM/F12培養基、EGF、bFGF、 B27添加劑、胎牛血清購自Gibco公司。大鼠神經小球分離試劑盒購自StemCell Technologies公司。巢蛋白（Nestin）多克隆抗體、神經元特異烯醇化酶（neuronspecific enolase，NSE）抗體、膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體、SABC-CY3免疫熒光試劑盒購自Boste公司。

1.1.2 NSCs培養基： 在基礎培養基DMEM/F12中加入 2% B27 、20μg/L 的EGF 及10μg/L 的bFGF 組成。

1.2 方法

1.2.1 NSCs的分離及原代培養： 取0～1 d的新生Wistar大鼠，75%酒精消毒，無菌條件下迅速斷頭取腦，分離雙側海馬，將組織剪成小碎塊，反復吹打至組織變為乳糜狀，通過200目的濾網，離心、棄去上清液，用NSCs培養基重懸，調整細胞密度在5×105 /mL，接種于50 mL 培養瓶中，置37℃，5%CO2培養箱中孵育，每2～3天半量換液一次，培養5～7天后當神經球直徑達到100～200 μm時，進行傳代。

1.2.2 NSCs的傳代： 當原代NSCs培養至5～7天后神經球直徑達到100～200 μm時，可進行傳代。將細胞球和培養基移入無菌的15 mL離心管中，離心、棄上清。采用StemCell公司的大鼠神經小球分離試劑盒進行傳代。將離心后的神經球用試劑盒A溶液0.5 mL重懸，加入試劑盒B溶液0.125 mL作用8分鐘，于作用3分鐘和7分鐘時用吸管輕柔吹打細胞懸液各8次，8分鐘后加入試劑盒C溶液0.04 mL，輕柔吹打8次，加入0.35 mL細胞培養液，使其最終體積為1 mL。離心、棄上清，NSCs培養基重懸細胞，按照5×105 /mL密度接種在完全培養基中，于接種后1、2、3、5 d在100倍倒置顯微鏡下隨機觀察4個視野，每種方法6個標本，計數神經球生長的個數。

1.2.3 NSCs免疫熒光鑒定： 取生長良好的第三代NSCs克隆球接種到6孔板中，待細胞球貼壁時吸出培養基，經固定、透膜后，加入1：100一抗（兔抗Nestin多克隆抗體）及1：100二抗，最后滴加1：100 CY3，用抗熒光萃滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 NSCs分化培養及鑒定： 將生長良好的第三代NSCs接種到6孔板中，培養液中加入終濃度為10%的胎牛血清，在經多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進行爬片。至分化培養3天后，將爬片取出，進行細胞免疫熒光鑒定，步驟同前，一抗分別1：200的兔抗NSE多克隆抗體及兔抗GFAP多克隆抗體。

1.2.5 統計學處理： 所測數據采用X±s表示，用SPSS 13.0統計軟件包進行統計學分析，兩組間比較采用兩組獨立樣本資料的t檢驗； P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠海馬NSCs的形態學觀察： 原代細胞接種后，即在相差顯微鏡下觀察為懸浮的圓形細胞，邊界清楚，折光性強，絕大部分成單個存在。接種24～48 h后，單細胞的比例顯著減少，大多數細胞懸浮在培養液中并形成小的細胞團，此為NSCs球。隨培養時間延長，細胞球逐漸增大，至5～7天時生長成為數十乃至上百個細胞的集落，呈球形、桑葚狀，折光性好。

2.2 NSCs傳代后細胞的形態學觀察： 體外培養的NSCs經大鼠神經小球分離試劑盒予以神經球分離后，絕大多數神經球分散成單細胞，背景清晰，細胞碎片較少。2～3天后重又形成新的細胞球，新細胞球生長快，數量多，體積大，折光性好。培養4～6天，細胞球直徑在100～200 μm，即可再次傳代。

2.3 NSCs鑒定、分化：原代和第三代NSCs克隆球Nestin細胞免疫熒光染色呈陽性。在NSCs培養液中添加10%胎牛血清數小時后，NSCs球即開始貼壁并分化，從球體向外生長出有很多細長突起的細胞。此后分化的細胞逐漸增多，且從細胞球中心向外遷移出來，呈放射狀。細胞免疫熒光染色顯示，在胎牛血清誘導分化下，NSCs可分化成表達NSE的神經元和表達GFAP的星形膠質細胞。從細胞形態、生長特點和免疫熒光染色結果都說明培養的細胞為NSCs。

3 討論

NSCs是一種原始的未分化細胞，它有和成熟神經細胞相同的基因，且具有自我更新、增殖和分化為神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞等多向分化的潛能。本實驗借鑒Vescovi等[3]的方法，以DMEM/F12為基礎培養基，輔以B27添加劑，同時加入bFGF及EGF構成完全培養基。在促進NSCs分裂方面，bFGF、EGF是最常用的兩種絲裂原。有文獻報道EGF可以促進NSCs進行對稱性分裂，而bFGF可促進NSCs進行非對稱性分裂 [4]，bFGF與EGF同時應用，bFGF可以顯著加強EGF的作用。本實驗將bFGF與EGF聯合應用，成功快速地培養出NSCs，并進行了有效地增殖和分化。Nestin屬于第Ⅵ類中間絲蛋白，僅在胚胎早期神經上皮表達，當神經前體細胞向終末方向分化為神經元和膠質細胞時，nestin即停止表達，因此被廣泛用于NSCs的鑒定。而成熟神經元和星形膠質細胞則分別表達其特異性標志物NSE和GFAP。本實驗對所培養的NSCs進行了nestin細胞免疫熒光染色，結果顯示培養獲得的細胞球nestin呈陽性。同時在含10%胎牛血清的培養基中，這些nestin陽性細胞球逐漸向外長出突起，分化為各種神經細胞，經細胞免疫熒光染色，這些細胞包含表達NSE的神經元和表達GFAP的星形膠質細胞，表明培養的NSCs具有多向分化能力。

NSCs的體外培養方式有神經球懸浮培養和單層貼壁培養兩種，目前大多采用的仍是懸浮培養的方法，形成的細胞克隆呈球狀生長，原代培養3-7天細胞球直徑可達100 μm以上，由數十乃至數百個細胞組成。位于球體中央的細胞由于缺乏營養，逐漸死亡，并影響其周圍的NSCs生長[5]，因此必須及時進行細胞球的分離，使之成為單細胞或小的細胞球。NSCs球的分離常用方法有兩種，即酶消化法和機械吹打法。酶消化法主要是通過胰蛋白酶水解細胞間的蛋白質使細胞分離，但是細胞膜上的蛋白質也可被消化從而引起細胞的損傷和死亡。機械吹打雖然避免了細胞膜被消化，但是反復的吹打可以造成細胞膜的機械損傷，亦可導致細胞活性下降及死亡，同時較大的神經球不易分離，也進一步減少了單細胞形成的數量。所以NSCs能否有效地傳代，最大程度地保持細胞存活，是體外大量增殖NSCs的關鍵。大鼠神經小球分離試劑盒通過化學解離的方法來分散神經球，減輕了對細胞的損傷[6]。實驗中我們發現，經過神經小球分離試劑盒分散的細胞，其細胞存活率及細胞擴增的數量均明顯高于機械吹打法分離的細胞。同時，神經小球分離試劑盒具有規范化的操作步驟，簡單易行，盡可能地減小了由不同操作者帶來的差異，更有利于實驗研究。因此，通過這種化學解離的方法可以快速高效地對NSCs傳代擴增，為實驗研究和臨床移植應用提供了便利。然而體內神經干細胞的增殖和分化，與體外培養有著一定的差距，它還受到周圍特殊的環境，即小生境的影響。因此利用體外培養的神經干細胞進行移植和基因治療還需要進一步的研究和探索。

參考文獻

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[3] Vescovi AL， Parati EA， Gritti A， et a1. Isolation and cloning of multipotential stem cells from the embryonic human CNS and establishment of transplantable human neural stem cell lines by epigenetic stimulation[J]. Exp Neurol， 1999， 156（1）： 71-83.

[4] Gritti A， Frolichsthal P， Galli R et a1. Epidermal and fibroblast growth factors behave as mitogenic regulators for a single multipotent stem cell like population from the subventricular region of the adult mouse forebrain[J]. Neurosci， 1999， 19（9）： 3287-3297.

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[6] 徐富翠， 鄒禮樂， 梅欣明. 神經干細胞培養及其影響因素[J]. 中國組織工程研究， 2013， 17（10）： 1835-1840.