使用多位點(diǎn)變異重復(fù)序列（MLVA）法分析臨床樣本中豬肺炎支原體的分子類型

中圖分類號：S855 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1001-0769（2014）02-0007-01

1 緒論

豬肺炎支原體（M. hyopneumoniae）是豬地方性肺炎的病原體，也是造成全球養(yǎng)豬生產(chǎn)損失的病因之一。多項(xiàng)研究報(bào)道，豬群中流行的豬肺炎支原體有多種毒株。因而急需要一種定型方法，以評估豬肺炎支原體的暴發(fā)、了解其致病機(jī)理和流行病學(xué)，同時(shí)評估控制該病的干擾措施。因此，本研究的目的是為豬肺炎支原體毒株鑒別方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，研究在美國豬群中流行的豬肺炎支原體的遺傳多樣性。

2 實(shí)驗(yàn)材料和方法

本實(shí)驗(yàn)以6個(gè)月內(nèi)送交至美國明尼蘇達(dá)大學(xué)獸醫(yī)診斷實(shí)驗(yàn)室的210份臨床樣本為研究對象。樣本使用DNeasy血液和組織診斷試劑盒提取純的基因組DNA。通過調(diào)整先前制定的分析方法，對多位點(diǎn)變異重復(fù)序列分析（Multilocus Variable Number Tandem Repeat Analysis，MLVA）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。該方法分析2份豬肺炎支原體附著因子蛋白（P97和P146 ）重復(fù)位點(diǎn)數(shù)量。熒光標(biāo)記引物加入遞減式PCR反應(yīng)中，以擴(kuò)增目標(biāo)位點(diǎn)。使用瓊脂糖凝膠電泳以確定擴(kuò)增子大小。每份樣本取10 μL，以1∶32的比例進(jìn)行稀釋，隨后提交至伊利諾伊大學(xué)進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析。未能通過毛細(xì)管電泳分析的樣本需利用標(biāo)準(zhǔn)Sanger測序法進(jìn)行測序，并且為分析中的添加物進(jìn)行人工計(jì)數(shù)重復(fù)位點(diǎn)。使用BioNumerics（Version 7.0）軟件分析MLVA模型。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)粒度范圍和染色情況，兩位點(diǎn)在電泳圖中可以得到清楚的鑒定，并按照重復(fù)位點(diǎn)的數(shù)值轉(zhuǎn)化為分類值。該分析的辛普森（Simpson）多樣性指數(shù)為：P97，D=0.908；P146，D=0.929；當(dāng)2個(gè)基因位點(diǎn)組合在一起時(shí)，D=0.908。對兩個(gè)位點(diǎn)組合后進(jìn)行的分析顯示，本研究所有樣本共有87種MLVA模型；其中最常見的模型是MLVA 9-26型（7.2 %），隨后分別是MLVA 15-25型（6.2 %）、MLVA 15-21型（5.2 %）、MLVA 11-15型（4.7 %）和MLVA 14-21型（4.3 %）。分析表明，明尼蘇達(dá)州的107份樣本有54種MLVA模型；其中，最常見的模型是MLVA 15-23型（12.2 %），隨后順次為MLVA 15-21型（10.3 %）， MLVA 8-7型（6.5 %）。根據(jù)地理位置，未發(fā)現(xiàn)有簇的存在。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)了大量的MLVA模型，這表明在美國豬群和美國國家水平上流行著多種豬肺炎支原體變異體。對從不同地區(qū)和不同疾病類型中縱向收集到的樣本有必要作進(jìn)一步的分析，以研究基因型的非隨機(jī)分布是否存在于高致病性菌株間。□□

原題名：Molecular typing of Mycoplasma hyopneumoniae in clinical samples using MLVA（英文）

原作者：V Neira-Ramirez，M Torremorell，P Rabinowitz，B Paccha和S Gibbs