豬圓環病毒2型（PCV2）：發病機理及與先天性免疫的相互作用（III，續完）

上期回顧：上期主要介紹豬圓環病毒臨床疾病（豬圓環病毒相關疾病、同事感染其他豬病病原）、治病機理（淋巴衰竭和免疫抑制）。

關鍵詞：豬圓環病毒2型；斷奶仔豬多系統衰竭綜合癥；豬圓環病毒相關疾病；致病機理；免疫相互作用；細胞因子

4 與宿主免疫系統的相互作用

4.1 感染免疫細胞

體外培養的單核細胞、肺巨噬細胞和單核細胞來源的巨噬細胞可以攝取PCV2，并且在它們的細胞質中可以檢測到PCV2特異性的抗原，雖然現在缺乏PCV2在單核細胞中復制的有力證據[91-93]。這說明這些免疫細胞可能不是PCV2復制的主要位置。還有證據表明，PCV2可在T和B淋巴細胞、來源于PBMCs的單核細胞和感染豬的氣管扁桃體中復制[89，90]。PCV2復制水平證明，來自氣管淋巴結的B淋巴細胞比來自PBMCs的更高[89，90]，說明B細胞可能是PCV2復制的靶位點。PCV2的內化作用已在經典的血液DC細胞和漿細胞樹突狀細胞上證實 [94]，DC細胞內PCV2的持續存在并不會降低病毒的感染力、導致細胞死亡或改變DC細胞的免疫功能[95]。PCV2可簡單地通過DC細胞對它們的吞噬和內吞作用進入細胞，而不是通過感染[95-97]（圖3）。不過，PCV2在DC細胞內安靜地不復制的感染，可能有利于病毒逃避宿主的免疫系統和促進PCV2利用DC細胞遷移的特性在豬群中傳播[95]。

PCV2可削弱干擾素產生細胞產生IFN-α和TNF-α的能力，從而抑制骨髓DC細胞自分泌和旁分泌的成熟過程[11，94]。在患有PMWS的豬體內發現T細胞和B細胞的MHC-II的高水平活化和早期表達，IL-2受體CD25的高水平表達[66]。此外，巨噬細胞內的PCV2會降低這些細胞的吞噬和殺菌能力，從而有利于PCV2的生存和傳播[91，92]。有報道稱，肺泡巨噬細胞感染PCV2后產生高水平的細胞因子，包括TNF-α、粒細胞集落刺激因子、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）和IL-8[91，92]。免疫細胞（如巨噬細胞和DC細胞）的功能改變會削弱肺臟局部防御機制，導致肺部組織損傷[91，92]。PCV2介導對自然干擾素產生細胞的抑制可能具有廣譜作用，且可影響由Toll樣受體（如TLR7和TLR9激活劑）和其它豬病毒病原誘導產生的免疫應答效應[98]，說明了PCV2對豬先天性免疫系統反應的調節可能會使豬對繼發或協同感染的病毒和細菌更加易感[98]（圖3）。PCV2與免疫細胞及淋巴系統的相互作用可能在PCV2的發病過程中起到重要的作用[11]；因此，深入了解PCV2與免疫細胞的相互作用，對將來設計有效的豬群管理辦法和疾病控制策略具有重要的意義。

4.2 IL-10和其他細胞因子在PCV2致病過程中的作用

作為一種靶向作用于淋巴組織和免疫細胞的病毒—PCV2，它的感染可以顯著地改變感染豬體內細胞因子的反應。感染PCV2引起PCVAD的豬體內IL-10和促炎性細胞因子，如IL-1和TNF-α表達水平上調，而IL-2和IL-4表達水平下調[11，18]。胸腺中IL-10基因表達上調與感染豬的胸腺衰竭和萎縮有關[99]。患PCVAD的豬胸腺中的IL-10基因以及扁桃體內IFN-γ基因的表達水平上調，脾臟中的IL-2和IL-12p40基因表達下調，扁桃體內IL-4基因表達下調，腹股溝淋巴結IFN-γ基因、IL-10基因、IL-12p40基因和IL-4基因的表達下調[100]。豬亞臨床感染PCV2在病理變化高峰期也會短暫出現IL-10水平上升[101]。與PCV2陰性豬相比，感染PCV2的豬，體內CD8+和CD4+CD8+雙陽性細胞數量顯著減少，進一步證實了PCV2感染會削弱宿主免疫反應[65]。

PCV2感染誘導豬體內MCP-1和巨噬細胞炎性蛋白-1（MIP-1）[102]的表達，說明MCP-1和MIP-1在淋巴結肉芽腫性炎癥反應中有潛在的作用。此外，PCV-2感染后發展為嚴重的PCVAD的豬，在其體內可以檢測到血清C-反應蛋白和IL-10[103]，進一步證實了促炎性細胞因子在PCV2發病機制中的作用。在感染PCV2的豬肺泡巨噬細胞中，TNF-α、IL-8、肺泡巨噬細胞來源的中性粒細胞趨化因子-II（AMCF-II）、G-CSF和MCP-1的基因表達顯著上升[91]。在患有PCVAD的豬中，體內PBMCs通過釋放IL-10和IFN-γ可以對PCV2抗原產生良好的反應，但是對絲裂原或超抗原只能產生很小的或沒有反應，只能產生少量的IL-4、IL-2或IFN-γ[99]。此外PCV2還可以下調或抑制IL-4和IL-2從PBMC的釋放，刺激促炎性細胞因子，如IL-1β和IL-8的釋放[99]，這說明了患有PCVAD的豬抗病毒感染的免疫功能受到減弱。

總體來說，IL-10和其它促炎性細胞因子在PCV2致病和PCVAD發生上發揮著重要的作用[11，18]。免疫細胞損傷和細胞因子失衡與PCV2感染引起的多系統疾病有關（圖3）。因此，了解細胞因子失去平衡的潛在機制，可能有助于設計出更好的防控策略，以通過增強宿主免疫系統來抵抗PCV2感染和PCVAD。

4.3 病毒與宿主蛋白之間的相互作用

PCV2可能通過衣殼蛋白與病毒依賴受體，如多種細胞內的粘多糖肝素、硫酸乙酰肝素和硫酸軟骨素[20，104]相互作用，因此對豬的多種組織和器官具有廣泛的親嗜性[97]。PCV2衣殼蛋白通過網格蛋白介導的內吞作用，結合并進入豬單核細胞3D4/31[105]，病毒的入侵似乎不依賴于發動蛋白和膽固醇，但是依賴于肌動蛋白和小GTP酶通路[106]。感染PCV2的豬腎細胞和感染PCV2的豬組織中與RNA剪切因子SPF30同源的細胞基因和透明質烷介導的移動受體上調（107）。在感染PCV2的豬淋巴結組織中，參與先天性免疫防御的細胞基因（TLR1、CD14、CD80），免疫抑制基因（FGL2、GPNMB），促炎性信號基因（半乳凝素-3）和高速加工基因（ANGPTL-4）的表達水平發生改變，說明PCV2在免疫抑制、炎性細胞浸潤和體重減輕方面具有作用[108]。多種細胞蛋白，包括互補因子C1qB、E3泛素連接酶家族成員MKRN1和促凋亡基因產物Par-4，可以與PCV2衣殼蛋白和Rep蛋白相互作用[109，110]（表1），不過病毒與這些細胞蛋白相互作用的生物學意義還不清楚。

PCV2的ORF3與PCV1的相比是截短的。在體外條件下，當哺乳動物細胞人為過表達PCV2的ORF3蛋白，ORF3蛋白會與pPirh2相互作用，并且與P53競爭結合Pirh2，消除p53自身穩定性，導致p53水平上升，誘導感染細胞凋亡。雖然PCV2能否在豬體內誘導感染細胞凋亡還充滿爭議[2，4]，PCV2的ORF3蛋白可能通過激活caspase-8和caspase-3通路誘導感染細胞凋亡[67]。PCV2的ORF3蛋白與G蛋白信使（RGS）調節因子結合，與LPS激活的豬PBMC的poRGS16共定位（表1）。PoRGS16可能參與了將ORF3蛋白轉移至細胞核[110，111]。PCV2復制時激活NF-κB，細胞用NF-κB抑制劑處理可以減少病毒的復制[112]，說明了NF-κB的活化在協同多種控制免疫反應的細胞基因表達上發揮重要的作用，從而促進病毒的復制。現在還不清楚病毒和細胞蛋白相互作用的細節，在這方面還存在許多未知的因素。小ORF3在病毒復制和致病機理上的表觀多功能性還有待驗證。目前我們甚至還不知道ORF3蛋白是否能在感染PCV2的豬體內產生。很明顯還需要在更多相關模型系統中探索病毒-宿主蛋白間的相互作用。

4.4 病毒DNA與宿主蛋白相互作用

PCV2的基因組DNA包含免疫調節序列，在PCV2 DNA方面，至少鑒定了五個含CpG基序的脫氧核糖核苷酸（ODNs）：其中四個ODNs刺激IFN-α的產生，還有一個具有IFN-α抑制活性[113]。PCV2 DNA的免疫調節序列基序可以通過與TLR9相互作用激活先天性免疫，導致IFN和其它抗炎性細胞因子的產生[9，114]。因此PCV2 DNA的免疫調節序列與宿主細胞相互作用可能是PCV2致病的潛在機制[113，114]。PCV2感染自然干擾素產生細胞后，抑制它們對ODNs和TLR7與TLR9激活劑的反應[98]。在感染PCV2前或同時感染PCV2時，PK-15和3D4/31細胞經IFN-α和IFN-γ處理，可增強PCV2的復制[115]。在PCV2基因組的Ori基因上發現了干擾素刺激反應元件（ISRE）的序列。如果用完整病毒的成分，而不是分離的，PCV2的ISRE在體外會影響PCV2復制的干擾素介導增強效應[117]，以及在感染PCV2豬的病毒致病機理中發揮重要作用[118]。能夠與PCV2基因組中ISRE結合的細胞蛋白包括干擾素調節因子-1（IRF-1a）和鋅指蛋白ZNF683[9]。了解病毒的序列及它們與宿主細胞的相互作用，可能有利于在將來疫苗研發具有低毒力的遺傳修飾疫苗病毒。

5 保護性免疫

5.1 疫苗和免疫

目前至少有四種商業化疫苗可以抵御PCV2的感染和PCVAD[14]。FosteraTM PCV （輝瑞動物保健公司），之前稱為 Suvaxyn?PCV2 One DoseTM （美國富道動物保健公司）是第一個美國農業部完全認證的疫苗，它基于滅活和致弱的嵌合病毒（非致病性PCV1表達PCV2a的免疫原性衣殼蛋白）[31，32]。3周齡或更大年齡的仔豬單次肌肉注射FosteraTM PCV疫苗，可預防PCV2病毒血癥的發生和感染。Circovac? vaccine （法國梅里亞公司）是基于PCV2a病毒的滅活疫苗。3周齡或更大的仔豬單次肌肉注射免疫Circovac? vaccine，小母豬和母豬則免疫兩次。Ingelvac CircoFLEX? vaccine（勃林格殷格翰動物保健公司），Circumvent? vaccine （英特威/默克公司）和Porcilis? PCV （先靈葆雅/默克公司）都是基于在桿狀病毒系統中表達PCV2a衣殼蛋白制備的重組亞單位疫苗[14]。這些商業化PCV2疫苗的有效性已經在可控的實驗性攻毒豬中進行了大量的研究。因為PCV2單獨感染豬不會發展為完整的臨床PCVAD，采用PCV2協同感染模型可盡可能模擬野外條件，研究疫苗的有效性。疫苗試驗研究證實疫苗對PCV2感染和PCVAD具有極好的有效性[42，119-125]。采用該疫苗后，PCVAD引起的仔豬致死率顯著降低，并且該疫苗可以成功地減少PCV2在歐洲、加拿大和美國豬群的致死率。

雖然目前基于PCV2a的商業化疫苗是有效的，但是研發針對目前全球流行的PCV2b基因型的疫苗是有意義的。此外MLV可能會提供更好的免疫保護，因為MLVs不僅能誘導體液免疫反應，還能誘導細胞介導的免疫反應抵抗PCV2感染[14]。田間PCV2的廣泛感染證明研發一種可以區別疫苗免疫和自然感染的標記疫苗具有充分的根據。PCV2基因組衣殼蛋白的C端可以承受至少27個氨基酸插入[34，35]，在C端表達短的免疫性抗原決定標簽的PCV1-2a致弱嵌合疫苗可以在感染豬產生針對PCV2的特異性中和抗體以及抗附加表位抗體[34，35]，這說明了致弱的表位標簽的PCV2或嵌合PCV1-2可以用作MLV的compliance標記。雖然目前PCV2免疫程序產生的免疫失敗案例很少，未來的研究仍然需要評估現在疫苗誘導的群體免疫對進化的PCV2、新出現的變異株或疫苗逃避突變株的有效性。

5.2 中和抗體和細胞介導的免疫保護的作用

中和抗體和細胞介導的免疫反應是抗PCV2感染重要的免疫相關保護[18]。PCV2感染豬誘導的病毒特異性中和抗體在大約接種后21 d[34，35，43，126]產生。PCV2實驗性感染的生豬，可以在PBMCs中檢測到針對PCV2特異性的中和抗體和IFN-γ基因表達，不過被動免疫的產生在感染豬中存在差異。中和抗體的缺失可能是PCV2感染增強的重要因素[127]。PCV2中和抗體的產生與防止體外病毒復制和體內發展成為PCVAD具有相關性[128，129]。PCV2衣殼蛋白免疫表位的圖譜已被繪制[126，130，131]，第47～57個氨基酸殘基和第165～200個氨基酸殘基包含中和表位。針對第47～57位和第156～200位的氨基酸殘基的中和抗體能否保護PCV2感染還有待深入研究。并不是所有豬在接種減弱嵌合PCV1-2a病毒疫苗后都會產生高水平的體液免疫，不過即使有的豬僅產生的低水平體液免疫，感染野生型PCV2后也會產生保護性免疫[132]。分泌IFN-γ的細胞對PCV2的感染表現為特異的反應，可能會促進豬體內病毒的清除[132]，CD4+和CD8+ T細胞衰竭會減弱病毒特異的IFN-γ反應[133]。因此，IFN-γ也可能與免疫保護具有重要關系。

6 總結

總的來說，PCV2是養豬生產上重要的病原。該病毒靶向作用于豬的免疫系統，引起免疫衰竭，導致感染豬群的免疫抑制和多系統性疾病。同時感染其它豬病病原或對豬使用疫苗和佐劑進行免疫刺激會加重PCVAD。PCV2內化進入免疫細胞有利于病毒在豬群的傳播，以及影響重要的免疫細胞如巨噬細胞和DCs細胞的功能。IL-10和促炎性細胞因子的上調可能在PCV2的致病機理上發揮重要的作用。病毒的DNA成分和蛋白會與多種細胞基因的相互作用，控制免疫反應促進病毒的復制。中和抗體和細胞介導的免疫反應是重要的抗PCV2感染的免疫保護。雖然現在有一些針對PCV2有效的商業化疫苗，但是全世界養豬業不斷報道出現PCV2突變株。

雖然自1998年發現PCV2后針對PCV2的研究已經取得了巨大的進步，但是還有許多問題有待闡明。還未發現對PCV2特異的細胞受體，PCV2生命周期的許多環節，包括脫殼、復制、組裝和釋放，還不是很清楚。作為感染哺乳動物的最小DNA病毒，PCV2復制非常依靠宿主細胞。因此了解病毒-宿主的相互作用是至關重要的，特別是在分子水平上與宿主免疫系統。鑒定參與到病毒-宿主相互作用的重要病毒和宿主因子以及闡明它們在病毒復制和致病的潛在作用也是重要的。雖然同時感染其它豬病病原和免疫刺激已經被證實是加重PCVAD的輔助因子，其它會引起PCVAD發生的宿主和病毒因子還不清楚。病毒基因組中能增強毒力的遺傳元件可能還有待深入研究。ORF3在誘導受感染細胞凋亡和致病機理上還充滿爭議，且有待深入研究。PCV2已經逐步具有復雜的機制逃避宿主的免疫反應，引起細胞因子及其他免疫系統失去平衡，導致PCVAD的發生。因此，將來的研究還需要調查PCV2與免疫細胞（如漿細胞DCs）相互作用的機制。

PCV2的進化速度比我們之前對DNA病毒預測的速度要快很多，PCV2遺傳變異株的出現及它們對現有疫苗有效性的影響還有待研究。雖然第一例臨床PCVAD病例在20世紀90年代晚期才發現，但該病毒在60年代就已經開始傳播[134]；病毒為何在20世紀90年代后期突然致病還是個謎。在實驗室條件下，PCV1可以感染人肝癌細胞[135]，人的糞便樣本中也能檢測到環狀病毒樣DNA的序列[136]，不過它們的生物學意義還不清楚。雖然PCV2經動物感染人還缺乏確切證據，但是在人輪狀病毒減毒活疫苗中發現PCV污染引發了對疫苗安全性的憂慮。很明顯在未來需要鑒定決定物種和組織嗜性的細胞和病毒因子，以評估PCV2人畜共患性的能力。□□

原題名：Porcine Circovirus Type 2 （PCV2）： Pathogenesis and Interaction with the Immune System（英文）

原作者：Xiang-Jin Meng（美國弗吉尼亞理工大學院獸醫學生物醫學和病理學系）