RP HPLC法測定人血漿中鹽酸環丙沙星血藥濃度

【摘 要】 建立測定人血漿中的鹽酸環丙沙星濃度的高效液相色譜法。方法：采用KromailC18（4.6mm×250mm）色譜柱，柱溫：35℃；流動相：檸檬酸（0.05mol[?]L-1）-乙腈—三乙胺（80：20：0.3），流速1.0ml[?]min-1；檢測波長277nm，檢測器靈敏度0.50AU[?]V-1。

【關鍵詞】 HPLC 環丙沙星 血藥濃度

鹽酸環丙沙星是新一代的喹諾酮類合成抗菌藥，具有抗菌譜廣、抗菌活性強（尤對革蘭陰性桿菌作用強），同時又具有口服吸收完全，體內分布廣泛等特點，國內外已廣泛用于臨床，取得了良好的治療效果。健康人口服鹽酸環丙沙星0.2g或0.5g后，其血藥峰濃度（Cmax）分別為1.21μg[?]mL-1和2.5μg[?]mL-1，達峰時間（Tmax）為1～2小時。廣泛分布至各組織、體液（包括腦脊液），組織中的濃度常超過血藥濃度，蛋白結合率約為20～40%。血消除半衰期（T1/2β）為4小時。可在肝臟部分代謝，代謝物仍具較弱的活性。口服給藥后24小時以原形經腎排出給藥量的40%～50%。以代謝物形式排出約15%。同時亦有一部分藥物經膽汁和糞便排泄。本文參考有關鹽酸環丙沙星生物體內血藥濃度測定方法[1]，建立了RP HPLC法測定環丙沙星在人體血漿中的藥物濃度。

1 材料

儀器：日本島津公司LC-10AT泵，KromailC18色譜柱（4.6mm×250mm），SiL-10A全自動進樣器，SPD-10A型紫外可見分光光度檢測器（190～600nm），NC-2000型色譜工作站。TGL-16G高速臺式離心機，超聲波發生器，YKH-Ⅱ型液體快速混合器（江西醫療器械廠）。

試劑：乙腈色譜純（山東省禹王實業總公司化工廠），其它試劑均為分析純，水為重蒸餾水，環丙沙星標準品由中國生物制品檢定所提供（30451-200302）。

標準溶液（63.6μg[?]mL-1）：精密稱取環丙沙星標準品適量，加甲醇溶解并稀釋使成63.6μg[?]mL-1，搖勻，置冰箱中冷藏備用。

2 方法

2.1色譜條件

色譜柱：KromailC18色譜柱（4.6mm×250mm），柱溫：35℃；流動相：檸檬酸（0.05mol[?]L-1）-乙腈—三乙胺（80：20：0.3），流速1.0ml/min；檢測波長277nm，檢測器靈敏度0.50AU[?]V-1，20μL定量環進樣。

2.2血漿樣品處理方法

精密吸取血漿樣品0.5mL置具塞離心管中，加入乙腈1000μL，渦旋30S，離心5min（10000r/min），分取上清液20μL進樣分析。

2.3方法的專屬性考察

由血漿樣品按本法分離測定所得色譜圖表明，空白樣品中內源性物質不干擾，通過與空白樣品添加標準品色譜圖比較，確證6.17min色譜峰為環丙沙星色譜峰，如圖1所示。

3 結果

3.1標準曲線的繪制

取空白血漿0.5mL5份分置具塞離心管中，依次加入環丙沙星標準溶液，使環丙沙星的血漿濃度分別為3.18，1.27，0.38，0.064和0.013μg[?]mL-1，按血漿樣品處理方法處理后經HPLC測定，以環丙沙星峰面積為縱座標，濃度C（μg[?]mL-1）為橫坐標，按加權最小二乘法[2]進行回歸，得血漿標準曲線為：Y=51485.7X+4142.74，r=0.9985（權重1/c2×102），線性范圍0.013～3.18μg[?]mL-1，最低定量限為0.013μg[?]mL-1。

3.2方法精密度與準確性

取空白血漿加入適量的環丙沙星標準液，配成0.013、0.382、3.18μg[?]mL-1質量控制（QC）樣品，每一個濃度進行5樣本分析，連續測定3d并與標準曲線同時進行，以當日的標準曲線計算QC樣品的濃度，將QC樣品的結果進行方差分析求算本法的準確度和精密度，結果見表1。

表1 人體血漿中環丙沙星準確度和精密度分析（n=15）

3.3回收率試驗

于空白血漿中加入一定量的環丙沙星標準貯備液，配制成0.013、0.382、3.18μg[?]mL-1的系列標準血漿QC樣本各3份，按“2.2”項下處理并進樣分析，以實測值與理論值之比計算相對回收率（%），3種濃度下樣品的相對回收率分別為（94.15±7.42）%、（101.14±4.99）%、（93.14±1.08）%，相對標準差分別為7.88%、4.93%、1.16%（n=5）。

3.4穩定性試驗

3.4.1室溫穩定性

于空白血漿中加入一定量的環丙沙星標準貯備液，配制成0.013、0.382、3.18μg[?]mL-1的系列標準血漿QC樣本各3份，于室溫分別放置不同時間后按“2.2”項下處理并進樣分析，與0h相比求得標準血漿樣本的偏差。結果表明，標準血漿QC樣本在8h內可保持穩定。

3.4.2凍融穩定性

于空白血漿中加入一定量的環丙沙星標準貯備液，配制成0.013、0.382、3.18μg[?]mL-1的系列標準血漿QC樣本各3份，于-20℃冷凍24h，取出待完全融解后按“2.2”項下處理并進樣分析，反復凍融3次，與未凍融前相比求得標準血漿樣本的偏差。結果表明，標準血漿QC樣本在凍融條件下可保持穩定。

3.4.2長期穩定性

于空白血漿中加入一定量的環丙沙星標準貯備液，配制成0.013、0.382、3.18μg[?]mL-1的系列標準血漿QC樣本各3份，于-20℃分別冷凍0、7、14、21d后，取出待完全融解后按“2.2”項下處理并進樣分析，與0h相比求得標準血漿樣本的偏差。結果表明，標準血漿QC樣本在-20℃條件下可保持30d穩定。

3.5血藥濃度測定

18名男性健康受試者單劑量口服鹽酸環丙沙星片500mg后，于服藥前和服藥后0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，24.0h取前臂靜脈血5ml，離心，分離血漿，于-20℃冷凍保存直至測定。在受試者血漿樣品測定過程中，每工作日建立一條標準曲線，同時配制血漿低、中、高三個濃度（分別為0.013、0.382、3.18μg[?]mL-1）QC樣本，每一濃度進行雙樣本分析，以判斷當日結果的可靠性。按“2.2”項下處理并進樣分析，測得18名受試者的血藥濃度如表2所示。

表2 18名志愿者口服500mg環丙沙星的血藥濃度（μg·mL-1）

4 討論

本文所建立的高效液相色譜法簡便、快速、準確，完全可以用來測定人體內的環丙沙星濃度，為臨床藥物監測提供了合理依據。

參考文獻：

[1]周秦秦，傅穎君，況榮華等.高效液相色譜測定鹽酸環丙沙星血藥濃度及其藥動學研究.中國醫院藥學雜志，1998，18（3）：114～116

[2]鐘大放.以加權最小二乘法建立生物分析標準曲線的若干問題.藥物分析雜志，1996；16（5）：343