5—脂氧合酶抑制劑治療Jurkat細(xì)胞移植瘤裸鼠的實(shí)驗(yàn)研究

【摘 要】目的：觀察5-脂氧合酶抑制劑NDGA（去甲二氫愈創(chuàng)木酸）對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）細(xì)胞系Jurkat細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長的影響。方法：選用Jurkat細(xì)胞裸鼠體內(nèi)接種成瘤后，腹腔注射給藥觀察其對(duì)腫瘤生長的影響。Western檢測(cè)細(xì)胞細(xì)胞周期蛋白p-ERK，Bcl-2/Bax的變化。結(jié)果：NDGA能抑制腫瘤的生長（P<0.01），使Jurkat細(xì)胞凋亡增加（P<0.05）。Jurkat細(xì)胞p-ERK，Bcl-2/Bax表達(dá)明顯下調(diào) （P<0.05）。結(jié)論：NDGA能抑制Jurkat細(xì)胞移植瘤的生長，促進(jìn)Jurkat細(xì)胞的凋亡。其作用機(jī)制與p-ERK，Bcl-2/Bax表達(dá)明顯下調(diào)有關(guān)。

【關(guān)健詞】急性淋巴細(xì)胞白血?。宦闶?；凋亡；p-ERK；Bcl-2；Bax

【中圖分類號(hào)】R-33 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1004-7484（2014）01-0042-02

急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）是一種較為常見的血液系統(tǒng)疾病之一。ALL約占占兒童白血病的75%，且近年來白血病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，每年新增病例約9000人（兒童和成人）[1]。因此，尋找行之有效的化療藥物具有十分重大的意義。去甲二氫愈創(chuàng)木酸 （NDGA）是常青黎科灌木Larrea tridentate中提取的一種抑制白三烯等代謝產(chǎn)物生成的脂氧合酶抑制劑，近年來國內(nèi)外研究表明其對(duì)部分腫瘤也有抑制作用[2]，但尚未見其對(duì)人白血病細(xì)胞系作用的報(bào)道。本文旨在研究NDGA對(duì)人急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的影響來探討其抗腫瘤活性的機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞株購自南京凱基生物有限公司。RPMI 1640培養(yǎng)基購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。小牛血清購自杭州四季青公司。裸鼠購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，在SPF級(jí)動(dòng)物合格環(huán)境下飼養(yǎng)。NDGA 購自Calbiochem公司。β-actin，p-ERK，Bcl-2和Bax抗體均購自Santa Cruz。辣根過氧化酶標(biāo)記物山羊抗小鼠IgG（二抗）和堿性磷酸酶顯色試劑盒購于北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理

Jurkat細(xì)胞接種于含10%胎牛血清體積分?jǐn)?shù)的RPMI 1640培養(yǎng)液 （pH值7.2-7.4，含100 u/ml青霉素和100 u/ml鏈霉素）。于37℃，5%CO2，飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 裸鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒓疤幚?/p>

所有實(shí)驗(yàn)裸鼠接種腫瘤前給予400cGy137Cs γ射線全身照射。取對(duì)數(shù)生長期的Jurkat細(xì)胞，用不含血清的RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次，重懸于RPMI 1640培養(yǎng)基，細(xì)胞濃度為5×107細(xì)胞/mL。充分混勻后取200 μ1細(xì)胞混懸，皮下接種于裸鼠的右背側(cè)。游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小，接種Jurkat細(xì)胞10天后挑選成瘤小鼠做為第（3）步實(shí)驗(yàn)對(duì)象，隨機(jī)分三組，每組5只小鼠：A組（對(duì)照組）、B組（生理鹽水組）、C組（NDGA組），NDGA組腹腔給予NDGA（10μM，0.1ml/10g，1/5d）處理，生理鹽水組組腹腔給予同等量生理鹽水。腫瘤體積的計(jì)算公式為π/6（Wl×W2×W 2），其中W1代表長徑，W2代表短徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后拉頸處死小鼠后，迅速分離瘤組織，分為2部分：一部分放進(jìn)0.1 %DEPC處理的細(xì)胞凍存管中，立即放進(jìn)液氮，備提蛋白；另一部分用10%中性甲醛固定24h，常規(guī)石蠟包埋，切片，作TUNEL檢測(cè)。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡細(xì)胞

各組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)依照TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明步驟進(jìn)行。結(jié)果的判定以細(xì)胞核著棕黃色者為陽性細(xì)胞。每個(gè)標(biāo)本觀察一張切片，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。凋亡細(xì)胞陽性指數(shù)（AI）的計(jì)算按以下公式進(jìn)行，AI=（凋亡陽性細(xì)胞數(shù)/總計(jì)細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.2.4 Western蛋白印跡法檢測(cè)NDGA對(duì)Jurkat細(xì)胞p-ERK，Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)的影響

取對(duì)各組小鼠腫瘤組織提取細(xì)胞總蛋白?？偟鞍诐舛冉?jīng)Bio-Rad測(cè)定，SDS-PAGE 凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。加稀釋一抗抗體（靶蛋白抗體）靜置過夜，TBST漂洗，加入二抗孵育，熒光顯色，沖洗。掃描蛋白印跡膠片后觀察結(jié)果，按照靶蛋白/β-actin蛋白比例用Scion圖像分析系統(tǒng)（4.02版本）分析條帶影像。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS 6.12和SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理， 腫瘤生長情況采用兩因素方差分析，western結(jié)果采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 NDGA對(duì)Jurkat細(xì)胞移植瘤生長的影響

結(jié)果顯示NDGA對(duì)Jurkat細(xì)胞移植瘤生長具有顯著抑制作用，與對(duì)照組和生理鹽水組相比，實(shí)驗(yàn)組腫瘤生長明顯變慢，不同組間腫瘤體積有顯著性差異（F=23.975，P<0.01）（圖1）。

2.2 NDGA對(duì)Jurkat細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL結(jié)果顯示NDGA對(duì)Jurkat細(xì)胞移植瘤具有明顯的凋亡誘導(dǎo)作用。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞凋亡率為13.45±4.86，與對(duì)照組的2.97±1.53和生理鹽水組的3.2±2.42相比，不同組間細(xì)胞凋亡率有顯著性差異（F=10.12，P<0.05）（圖1）。

2.3 NDGA對(duì)Jurkat細(xì)胞p-ERK，Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)的影響

經(jīng)NDGA作用后Jurkat細(xì)胞移植瘤組織p-ERK蛋白表達(dá)降低至0.31±0.08，與對(duì)照組和生理鹽水組的0.64±0.12和0.59±0.11比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.979，P<0.05）；Bcl-2蛋白表達(dá)降低至0.22±0.1，與對(duì)照組和生理鹽水組的0.51±0.1和0.48±0.13比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.007，P<0.05）；Bax蛋白表達(dá)增高至0.39±0.11，與對(duì)照組和生理鹽水組的0.1±0.08和0.09±0.08比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.665，P<0.05）；

3 討論

急性淋巴細(xì)胞白血病是兒童白血病主要類型之一，近年來其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。雖然近年來急性淋巴細(xì)胞白血病的診斷和治療手段有了很大的提高，但是仍有高達(dá)20%的ALL患者出現(xiàn)白血病復(fù)發(fā)，因此，尋找新的治療急性淋巴細(xì)胞白血病的化療藥物具有重要意義。5-脂氧合酶（5-LOX）是脂氧合酶同工酶中的一種，是機(jī)體內(nèi)催化花生四烯酸生成生物活性分子白三烯的關(guān)鍵酶[3]。傳統(tǒng)認(rèn)為5-LOX主要來源于白細(xì)胞、肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，通過誘發(fā)炎癥、增強(qiáng)白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的趨化而參與哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等病理生理過程。近年來隨著研究的深入，人們?cè)谀[瘤細(xì)胞、神經(jīng)元、平滑肌細(xì)胞等多種組織細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)5-LOX表達(dá)，表明它在腫瘤發(fā)生、發(fā)展等多種病理生理過程中都發(fā)揮著重要的作用[4]。NDGA是一種廣譜脂氧合酶抑制劑，它能夠抑制5-LOX的活性。本研究證實(shí)NDGA對(duì)Jurkat細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的有顯著的生長抑制作用，與上述報(bào)道有一定的相似性。

細(xì)胞凋亡作為一種有別于壞死的細(xì)胞死亡方式，是一種基因控制的主動(dòng)的、受多種基因調(diào)控、自發(fā)生、多種酶參與的復(fù)雜過程，目的為維護(hù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡一直是腫瘤研究的熱點(diǎn)[5]。為此本實(shí)驗(yàn)觀察了NDGA對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞凋亡的影響：流式細(xì)胞儀可發(fā)現(xiàn)NDGA作用后急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞的凋亡率高于對(duì)照組，成時(shí)間依賴性上升，表明NDGA可有效地誘導(dǎo)急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞的凋亡。

腫瘤細(xì)胞的凋亡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及對(duì)化療和放療的抵抗密切相關(guān)。在細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程中涉及眾多信號(hào)分子，其中Bcl-2家族是凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)中最重要的基因家族之一，起著至關(guān)重要的作用。Bcl-2家族成員按在細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程中功能不同分為：抗凋亡和促凋亡兩大類，其中促凋亡蛋白的Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2是研究最深的一對(duì)，二者相互拮抗，有研究表明Bcl-2/Bax比值的降低可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。NDGA作用于后可引起B(yǎng)cl-2基因表達(dá)的下調(diào)，隨著時(shí)間的延長Bcl-2表達(dá)的下調(diào)作用更為顯著；而Bax基因表達(dá)隨著作用時(shí)間的延長成時(shí)間依賴性升高，提示NDGA誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的作用是通過抑制凋亡抑制基因Bcl-2和促進(jìn)凋亡促進(jìn)蛋白Bax的表達(dá)來起作用的。

從本研究看NDGA能夠抑制人急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞的生長，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。從這一結(jié)論可以看出，NDGA可望成為臨床上治療急性淋巴細(xì)胞白血病的有效藥物，但其作用途徑和機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究。

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