不同年齡健康人群腸道微生態的變化

【文章編號】1004-7484（2014）01-0102-02

在人體，腸道菌群是一個復雜的微生態系統，目前在腸道中細菌已知多達 500 余種，大約1013～1014個，厭氧菌約占98%以上。腸道菌群的種類和數量是相對穩定的， 受飲食、內分泌、衛生習慣、地理環境、年齡及衛生條件的影響而變動。本研究以不同年齡階段的健康人群為對象，通過常規細菌培養及熒光定量PCR來檢測其腸道菌群的數量，進一步研究腸道眾多菌群與年齡關系，希望找到長壽老人相關腸道菌群。

1 對象與方法

1.1 對象

共收集健康人群糞便標本81例，其中：少年組26例，男性16例，女性10例，年齡范圍8-15歲，平均年齡12.3歲；青壯年人群30例，男性17例，女性13例，年齡范圍27-50歲，平均年齡36.7歲； 老年人群25例，男性15例，女性10例，年齡范圍65-80歲，平均年齡71.2歲。三組人群采樣前無腹瀉便秘等胃腸道疾病、肝膽疾病及心腦腎等重要臟器疾病史，4周內未用過微生態活菌制劑（如酸奶）及抗生素。

1.2 方法

1.2.1實驗者留取糞便標本于無菌袋中，置入厭氧罐內，立即送檢分離，所需時間嚴格控制在30min之內。

1.2.2目的菌群定性、定量檢測方法

常規細菌培養：無菌獲取新鮮糞便1g，置稀釋液A內，振蕩器制勻漿，依次連續10倍稀釋到10-8，于不同稀釋度取標本液50uL并用“L”棒涂抹于不同培養基上，依據研究目的，對所選目的菌進行定性定量檢測。

非選擇性培養基：腸道厭氧菌培養基BL、腸道需氧菌培養基；

選擇性培養基：雙歧桿菌培養基、類桿菌培養基、乳桿菌培養基、腸桿菌培養基、腸球菌培養基、酵母菌培養基。

培養條件：厭氧菌培養采用厭氧盒，于37℃培養48 h～72 h；需氧菌用普通溫箱37℃培養48h。

菌種鑒定：厭氧菌三級鑒定法。采用API生化鑒定系統，將細菌鑒定到屬水平。檢測下限為2×10-1 CFU/g濕便。

熒光定量PCR：糞便總DNA抽提：采用QIAamp? DNA糞便袖珍試劑盒（Qiagen， Hilden， German）抽提糞便總DNA，按試劑盒說明操作。所有抽提獲得的糞便總DNA置于-80℃保存備用。PCR擴增：采用相應特異性引物，在不同條件下擴增腸桿菌、乳酸桿菌、類桿菌以及雙歧桿菌（4種菌屬）DNA。定量PCR儀檢測：采用MJ Opticon 2定量PCR儀（Bio-Rad， USA）及MJ Opticon MonitorTM分析軟件（Version 3.1）分析糞便中細菌基因拷貝數。

1.3統計學處理

所有數據用均數±標準差表達，兩組比較采用成組的檢驗，多組比較采用方差分析，P<0.05 為差異有統計學意義，所有的統計學分析均用SPSS10.0進行處理。

2結果

2.1 糞便細菌培養結果

2.1.1少年組、靑壯年組、老年組三組腸道菌群值及B/E值比較

老年組腸桿菌較少年組及靑壯年組明顯增加（8.51±0.99VS 9.57±1.11 p<0.05；8.29±1.09 VS 9.57±1.11 p<0.01），少年組及青壯年組之間對比無差異；腸球菌及類桿菌菌群值與少年組及靑壯年組對比有增加，經統計學分析明顯差異；雙歧桿菌及雙歧桿菌與腸桿菌的比值（B/E值）老年組則明顯降低，見表 1。

3討論

腸道微生態與人的壽命、 健康密切相關。微生態平衡時，腸內細菌就有益于人體，而在微生態失衡時，有害菌產生的毒性物質或內毒素的釋放，以及腸內細菌導致的內源性感染等又會引發疾病的產生， 加速衰老和死亡。老年人正常微生物種類與數量的改變與疾病的發生、 發展之間存在著非常微妙的關系。體腸道是一個巨大的細菌庫， 人的胃腸道棲息著大約30 屬550 多種細菌， 主要由厭氧菌 兼性厭氧菌和需氧菌組成， 其中專性厭氧菌占99%以上， 而僅擬桿菌及雙歧桿菌就占細菌總數90%以上[1]，沿著胃腸道，腸道微生態的分布不同[2- 3]。人體腸道正常菌群在腸腔內形成3個生物層：深層近黏膜為膜菌群，由雙歧桿菌和乳酸桿菌組成，屬共生菌；中層為厭氧菌，包括消化鏈球菌、優桿菌等； 表層為腔菌群，主要是大腸桿菌、腸球菌等需氧和兼性厭氧菌。它們以一定的數量和比例，存在人體的腸道中，起營養、生物拮抗、免疫、 促進生長、抗腫瘤和防止衰老的作用[4]。雙歧桿菌通過利用短鏈糖類物質而大量繁殖，形成競爭的微生態環境，從而抑制致病菌的生長，乳桿菌則是通過產酸降低腸道的pH值，從而達到形成不利有害菌生長的酸性環境，它們已是公認的腸道益生菌，與宿主終生相伴。菌群失調是指腸道原籍菌發生定性或定量的改變，出現益生菌與致病菌比例明顯改變。雙歧菌與腸桿菌的比值（B/E 值）可以用來作為腸道定植抗力的指標，腸道定植力即指包括雙岐桿菌在內的專屬厭氧菌對腸道需氧的潛在致病菌群的抑制作用，其比值小于1 表示腸道定植抗力受損[5] 。通過本次研究發現老年組雙歧桿菌值較少年組及青壯年組明顯減少，（9.25±0.86 vs 8.56±0.89 p<0.05； 9.44±0.72 vs 8.56±0.89 p<0.01 ）見表1；熒光定量PCR分析發現老年組乳酸桿菌值較青壯年組下降（6.95±0.53vs 7.65±0.26 p<0.05），見表2，而傳統的細菌培養兩者見無差異，見表1。我們同時對各組間的B/E值進行對比，發現本組老年組的B/E值小于1，與少年組及青壯年組對比明顯下降，經對比有明顯統計學差異（0.89±0.13vs1.09±0.15 p<0.01；0.89±0.13vs1.14±0.20 p<0.01，以上均說明性老年人的腸道生物屏障功能減弱，定植抗力下降， 易發生腸道菌群的失調。

腸球菌及腸球菌是人類和動物腸道正常菌群的一部分，腸道受到外界影響處于病理狀態或用藥不合理的情況下會轉變為致病菌，是院內感染的重要病原菌，此次研究我們發現老年組無論腸桿菌還是腸球菌值較少年組及青壯年組均增加，特別是腸桿菌，增加明顯（9.57±1.11vs8.51±0.99 p<0.05； 9.57±1.11vs8.29±1.09 p<0.01 ）。提示在同樣的外界刺激下，老年更容易致病。

綜上所述，隨著年齡的增長，腸道腸桿菌、腸球菌的菌數量明顯增加，雙歧桿菌、乳桿菌數量顯著減少，B/E 值下降，腸道微生態出現演替性變化，腸道定植抗力減弱，抵抗病原菌侵襲能力降低，易于引起感染。下一步我們將繼續就如何調節老年人腸道微生態，保護腸粘膜展開研究。

參考文獻：

[1] Biagi E，Nylund L，Candela M，et al.Through ageing，and beyond：gut microbiota and inammatory status in seniors and centenarians[J].PLoS ONE，2010，5（ 5）： e10667.

[2] Ouwehand A，Vesterlund S.Health aspects of probiotics[J].Idrugs，2003，6（ 6）： 573- 580.

[3] M?kivuokko H，Tiihonen K，Tynkkynen S，et al.The effect of age and non-steroidal anti- inflammatory drugs on human intestinal microbiota composition[J].Br J Nutr，2010， 103（ 2）：227- 234.

[4] 徐志毅.腸道正常菌群與人體的關系[J].微生物學通報，2005，32（3）：117.

[5] 吳仲文，李蘭娟，馬偉杭，等.腸道微生物定植抗力的新指標-B/E值[J].浙江預防醫學，2000，12（7）：4-5.