法尼酯X受體(FXR)在大鼠膽管損傷修復中的表達研究

摘要：目的：醫源性膽管狹窄已是老問題，但當前仍然具有重要意義，從國內、外有關的大量文獻報道中可見一斑[1]。據美國的資料顯示，在一組160萬例的腹腔鏡膽囊切除術中，膽管（肝外）損傷率為0.5%。生理性膽管損傷的膽道自我修復過程中涉及到多種信號通路，國內外研究證實法尼酯受體X（farnesoid X receptor，FXR）可能對此信號通路具有阻斷作用。本實驗旨在探討法尼酯X受體（FXR）在大鼠膽管損傷修復中的表達，通過大鼠膽管上皮FXR時間表達與血液中膽汁酸含量對比關系，闡明FXR在膽道修復中的作用。方法 用蛋白凝膠電泳法檢測FXR 在大鼠損傷膽管、生理鹽水處理膽管及正常膽管膽管組織中的表達。采用等級秩和檢驗統計分析；使用SPSS15.0 分析軟件包分析數據；P<0.05 為有顯著性差異。結果 FXR在大鼠損傷膽管中表達有統計學差異，P<0.05。FXR在膽管損傷修復的過程中呈陽性表達，膽汁酸濃度越高，FXR在膽管中的表達越低，而且表達強度隨損傷后的時間延長而減少。結論：FXR 可能是一個保護性受體之一，其表達上升可能是膽管損傷修復的機制的一部分。在膽道損傷中炎癥介質的釋放可能抑制了其表達，通過激活其表達有望對加速膽管損傷的修復起到一定作用。

關鍵詞：膽道損傷；法尼酯受體X；修復

【中圖分類號】R575.7 【文獻標識碼】A 【文章編號】1672-8602（2014）11-0011-01

醫源性膽管損傷是膽囊切除術最嚴重的并發癥，早已為人們所熟知和警惕，但仍時有發生，此外胃大部切除術、肝切除術、肝破裂修補術時也可發生。術后突出表現為膽道瘢痕性孿縮和膽管狹窄，膽道損傷后的過渡修復可能是其產生的重要原因之一，其機制尚不明確。法尼酯X受體（farnesoid X receptor，FXR）屬于代謝性核受體的一個亞族，能調節多種FXR靶基因的表達。FXR在肝臟、腸、腎臟、腎上腺高表達，而在脂肪組織和心臟中低表達[2-3]。 作為一種關鍵的代謝調節劑，FXR有著比人們以往認為的更廣泛的作用。最近有越來越多的研究證明法尼酯X受體與炎癥和膽汁淤積這兩大病理過程有著密切的聯系[4-5]。本實驗的目的是通過觀察FXR在大鼠膽道損傷修復過程中的表達情況，觀察其與血清膽汁酸含量的對比關系，明確FXR在膽道損傷后膽道修復過程中的作用，從而進一步探討膽道損傷后的修復機制，為膽道損傷的正確治療及預防提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

選用健康wistar大鼠60只，雌雄不限，體重200g左右，通過手術建立膽總管導管動物模型。將大鼠隨機分為3組，一組為假手術組，一組為生理鹽水灌注組，另外一組為過氧化氫灌注組。觀察給藥后1、3、7、14天損傷及修復期的膽管中FXR的表達情況及血清中總膽汁酸的含量。所有標本采集血清后采用全自動生化分析儀測定膽汁酸含量，采用免疫電泳測定膽管上皮內FXR蛋白免疫印跡實驗。

1.2 方法

1.2.1 實驗操作：

實驗動物稱重、麻醉：按照體重給予%戊巴比妥鈉腹腔注射，0.3ml/100g，10-15分鐘大鼠麻醉。固定，開腹：大鼠后仰臥固定于手術臺，按照無菌手術操作切開腹腔，暴露膽總管及十二指腸。假手術組僅完成開腹手術，不做插管。以穿刺法將聚乙烯塑膠導管插入膽總管管腔，另一端與預先已插置于頸部的導管栓連接，再以縫線和快干膠固定。術后逐層縫合：生理鹽水組恒速灌流15min；過氧化氫組（300umol/L）灌流15min。術后處理：術后禁食水24小時，給予青霉素G（80000U）預防感染。

1.2.2 標本收集

術后的大鼠，經24小時喂養后，斷頭處死并取血5ml，開腹取膽總管。血液樣本于冰上放置10min，隨后4℃，14000rpm離心15min，取上層血清樣本于-80℃凍存。組織樣本稱重，按樣本與裂解液比例1：3-3.5w/v（重量/體積）加入裂解液。一般為150-170mg：500ul。將組織放入預冷研缽充分短時研磨，同時加入50×Cocktail蛋白酶抑制劑。收集勻漿液于冰上靜止30min，期間利用超聲振蕩器于4℃振蕩三次，超聲3-4s/次，強度為最大強度的3/4.間隔10s，至溶液透明。隨后于4℃離心20min，14000rpm。收取上清液，分裝，-80℃凍存。

1.2.3 電泳

Western Blotting：提取組織/細胞蛋白質，并測定蛋白含量。對細胞抽提液進行SDS-PAGE電泳。將蛋白質電轉移到硝酸纖維素膜上，并干燥。將硝酸纖維素膜至于平皿中，加入封閉液（脫脂奶粉），室溫輕輕震蕩2-3小時。加入I抗，4℃輕輕震蕩2小時，PBS洗3次。將膜轉入150mM NaCl， 50 mM Tris-HCl（PH7.5）的溶液中，室溫輕輕震蕩10分鐘；加入II抗，室溫輕輕震蕩1小時；取出纖維素膜，150mM NaCl， 50 mM Tris-HCl（PH7.5）溶液中洗3-5次。顯色，照像。

運用圖像分析軟件對目標條帶掃描，且分析條帶的光密度值。結果與內參數據進行倍比處理。

1.2.4 統計學處理

采用等級秩和檢驗統計分析；使用SPSS15.0 分析軟件包分析數據；P<0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1、膽汁酸含量結果分析

經過統計學處理，提示膽道H2O2灌注造成膽道損傷，膽道中膽汁酸的濃度較假手術組及生理鹽水灌注的表達有統計學差異（P<0.05）。在大鼠損傷膽管、生理鹽水處理膽管及正常膽管組中術后1d、3d、7d、14d血清中總膽汁酸的含量（見表1，圖1）

2.2、FXR表達量結果分析

FXR在術后各期表達均較強， 無顯著性差別， 與假手術組與生理鹽水組比較，FXR表達存在顯著性差異（均P <0.05）。在大鼠損傷膽管、生理鹽水處理膽管及正常膽管組中術后1d、3d、7d、14d膽管中FXR表達量（見圖2）

3、討論

膽管損傷自身修復的過程涉及到多種信號通路，其中IL-6/gpl30/STAT3信號通路就是比較典型的一個，而TGF-β1是與瘢痕形成關系最密切、最具代表性的生長因子。近來有大量研究指出法尼酯X受體（FXR）與IL-6、TGF-β1、IL-1等炎性介質的表達有一定關系。這為我們解決膽道損傷后狹窄的問題提供了一個新思路。另外，已有研究表明膽汁酸激活FXR能夠促進肝臟再生，抑制肝纖維化，那么對于同樣與膽汁酸密切相關的膽道組織的損傷后修復的過程中，FXR的表達情況會是怎樣呢？

生理濃度的初級膽汁酸如鵝脫氧膽酸（ chenodexycholic acid， CDCA）、膽酸能與FXR在體外結合，并可募集輔活化子與FXR 配體結合域的結合；且該類配體不能與其他核受體相結合； 而其他核受體的配體對FXR的活化也沒有影響。以上證據表明膽汁酸是作為配體與FXR結合的。本實驗結果提示：FXR在膽管損傷修復的過程中呈陽性表達，膽汁酸濃度越高，FXR在膽管中的表達越低，而且表達強度隨損傷后的時間延長而減少。膽汁酸的濃度影響了FXR在膽管中的表達，提示膽汁酸或膽汁酸中的某一成分抑制了FXR在膽管中的表達。

另有報道提示膽汁淤積引起的的炎癥可抑制FXR的表達和活性，FXR或FXR調解基因的缺失可導致膽汁淤積，最后FXR激動劑可GW4060通過上調FRX可顯著減輕肝內外膽汁淤積小鼠模型的肝損傷，減少肝內炎癥細胞浸潤，抑制膽管增殖。本實驗通過膽道H2O2灌注造成膽道損傷，膽道中FXR的表達較假手術組及生理鹽水灌注的表達有統計學差異，這提示通過激活FXR的高表達，阻斷IL-6/gpl30/STAT3信號通路，可能抑制Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白的合成，并加速ECM的分解，從而減輕膽管損傷后的瘢痕攣縮，減少膽道狹窄的發生。本研究提示FXR可能是一個保護性受體，在膽道損傷中膽汁酸及炎癥介質可能抑制了其表達，激活其表達有望是膽管損傷修復的新靶點。

參考文獻

[1] 黃志強.醫源性膽管損傷：老問題，新意義[J].中國實用外科雜志，1999，19（8）：451-452.

[2] 黃志強.必須重視腹腔鏡膽囊切除術的安全性[J]. 中華外科雜志，1995， 33（11）：645-646.

[3] Bishop-Bailey D， Walsh DT， Warner TD. Expression and activation of the farnesoid X receptor in the vasculature. Proc Natl Acad Sci U S A 2004； 101：3668-3673

[4] Trauner M. The nuclear bile acid receptor FXR as a novel therapeutic target in cholestatic liver diseases： hype or hope？[J]. Hepatology，2004，40（1）：260-263.

[5] 陳莉萍，郭毅斌，戴睿武，等.IL-6/STAT3活化在大鼠肝移植膽管上皮細胞增殖中的作 [J].解放軍醫學雜志，2008，33（2）：155-158.等