Colo205來源大腸癌始動細胞分轉移相關基因的表達分析

【摘要】目的 獲得大腸癌始動細胞轉移相關基因表達變化譜，其細胞生物學特性研究提供依據。方法 "采用無血清懸浮培養、CD133抗體標記磁珠分選Colo205不同細胞群，體外分化實驗及裸鼠成瘤實驗鑒定細胞特性，表達譜測序分析轉移相關基因表達變化。結果：3種細胞群中有14種癌癥轉移相關基因發生顯著地表達改變。 結論：無血清培養基培養結合CD133磁珠分選Colo205細胞獲得的CD133+細胞亞群具備大腸癌干細胞的基本特征且有14種轉移相關基因表達發生顯著改變，可用于后續生物學特性研究。

【關鍵詞】始動細胞;大腸癌;表達譜測序;轉移基因

Abstract： Objective To obtain differential genes for research of colorectal cancer initiating cells biological behavior. Methods Initiating cells were sorted by by CD133 microbead kit and RNA-seq was employed for analysis of differential genes. Results Expression levels of 14 metastatic genes were changed on the levels of mRNA. Conclusion Colorectal cancer initiating cells were obtained and expression of 14 metastatic genes has been changed on the level of mRNA.

Keywords： Colorectal cancer; initiating cell; metastatic genes; RNA-seq.

【中圖分類號】R4 " "【文獻標識碼】A " "【文章編號】1671-8801（2014）011- 0001-02

大腸癌（colorectal cancer）是目前國內發病率次僅于肺癌、乳腺癌的嚴重危害人類健康的惡性腫瘤，近年來結腸癌的發病率呈逐年上升趨勢[1，2]。一般認為大腸癌發病機制與環境、遺傳、大腸腺瘤以及慢性大腸炎癥有關的涉及多個癌基因激活和抑癌基因失活漸變過程[3，4]。 腫瘤干細胞理論認為癌癥難以治愈的一個重要原因是腫瘤中具有干細胞（Stem Cell）性質的癌細胞即腫瘤始動細胞（Cancer initiating cell）的存在 [5]。 大腸癌干細胞是消化道惡性腫瘤中第一個被發現的癌癥始動細胞，分選并鑒定不同來源的腸癌始動細胞對于其后續的生物學特性分析、大腸癌診斷及綜合防治措施的制定等具有極為重要的意義[6]。本研究通過CD133+

標記的免疫磁珠分選大腸癌始動細胞，利用體外分化實驗和裸鼠成瘤實驗對分選的大腸癌始動細胞的干細胞特性進行鑒定和驗證，并用RNA-seq研究了腸癌轉移基因表達變化，共有14個大腸癌轉移相關的基因的表達水平發生改變。可為腫瘤分類與分型的基因標記物以及藥物治療潛在靶點的發現，深入理解大腸癌腫瘤的發生機制，以及大腸癌的臨床治療提供依據。

1. 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株與動物 "人大腸癌colo205細胞株購于中國科學院上海生命科學院細胞庫; 4周齡BABL/ c雄裸鼠購自第三軍醫大學大坪醫院動物中心，9只，體重20-25g，飼養于遵義醫學院醫學與生物研究中心SPF動物飼養房。

1.1.2 主要試劑TRIzol?、 B27添加劑（B27）及實驗所需生長因子購自Invitrogen公司;二甲基亞砜（DMSO）、胰蛋白酶粉購自Sigma公司;培養基及血清購自Gibco公司; CD 133細胞分選試劑盒 "（CDl33 Cell Isolation Kit） 購自Miltenyi公司。常規細胞培養等無酶耗材均購自杭州愛思進公司。無血清培養基（serum free medium，SFM）為本實驗新鮮配制（98ml DMEM/F12培養基含2.0ml B27，0.2μg bFGF， 0.2μg LIF，0.2μg EGF， 加超純水定容到100ml，過濾滅菌，- 20℃保存，備用）。表達譜測序全套試劑購自Illumina公司。

1.2 方法

1.2.1 Colo205始動細胞分選 "取對數增長期Colo205細胞，以105/ mL的細胞密度接種至SFM中培養;每2～ 3d加入2ml SFM培養基換液;10d后用酶消化法及機械分離法將colo205干細胞球分離成單細胞懸液后傳代。將形態穩定的colo205干細胞單細胞懸液加入100μl FcR blocking及100μl CD133免疫磁珠， 4℃孵化30min;分選 Buffer洗滌細胞，800rpm、離心10min，棄上清。分選Buffer重懸細胞，將細胞懸液過柱，收集CD133-細胞，用500μl分選 和CD133+陽性細胞。

1.2.2體外分化及裸鼠成瘤試驗

將分選所得CD133+與CD133-細胞密度調整至105/ml接種SFM培養，每2-3天加入2ml SFM培養基。10d天后向SFM中加入胎牛血清（SFM與胎牛血清的體積比為9：1），繼續培養。將分選得到CD133+、CD133-細胞及未分選的colo205細胞分別用生理鹽水稀釋，以1×103、1×104、1×105細胞數量分別將CD133+、CD133-細胞及未分選的colo205細胞接種至同一只babl/ c裸鼠左右腋下和右側腹股溝后飼養于SPF級動物房，觀察腫瘤生長情況并拍照。

1.2.3 "RNA-seq及生物學信息學分析

用TRIzol?總RNA提取試劑盒提取5g以上的總RNA（OD260/OD280≈1.9～2.0），利用Dynabeads? mRNA試劑盒利用磁珠法分離純化mRNA后樣品委托上海美吉生物技術公司進行高通量測序文庫的構建及數據處理。CD133+組/Colo205組/CD133-等3組樣品間兩兩樣品的轉錄本的表達量變化差異顯著，以Plt;0.05和qlt;0.05和表達變化差異為-2和2倍為差異表達基因篩選標準。

1.2.4 差異基因定量PCR驗證 "為了進一步驗證表達譜測序獲得基因表達變化數據的可靠性，我們隨機選取了p53和BCL11A基因，并以?-actin基因作為內參，進行表達變化的定量PCR驗證。P53F，5-′ CCCTCCTCAGCATCTTATCCG-3′; P53R， 5-′CAACCT CAGGCGGCTCATAG-3′;BCL11AF "5-′GACAGGGTGCTGCGGT TGA -3′，BCL11AR 5-′ GGCTTGCTACCTGGCTGGAA -3′;?-actin 引物：?-actin F 5-′ TGGCACCCAGCCAATGAA-3′， ?-actin R 5-′ CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。定量PCR反應條件為：95℃ 預變性2mim，40個熱循環擴增（95℃變性 10s ， 60℃ 退火擴增 20s），獲得Ct值，以2-△△Ct法進行表達變化分析。

2. 結果與分析

2.1 大腸癌始動細胞體外分化及成瘤能力 "大腸癌Colo205細胞SFM培養基培養1d內可見大部分細胞貼壁，隨傳代次數增多，細胞團趨于球型。CD133+細胞培養1d后，細胞成團并懸浮生長，4d可見典型腫瘤細胞球出現，加入胎牛血清， CDl33+細胞形態與之前在SSM培養基中的Colo205 細胞相同（圖1. D），CDl33-細胞則始終未見腫瘤細胞球生成。

不同細胞群細胞接種裸鼠，S第15天見105個CD133+細胞接種處開始見腫瘤生長，瘤體迅速增大;第20天104個CD133+細胞接種處見腫瘤生長;接種第30天103個CD133+細胞接種處見腫瘤生長;接種第35天105個colo205細胞接種處見腫瘤生長;第40天104個和103個colo205細胞及CD133-細胞接種處未見腫瘤生長。到42天觀察期結束，僅需接種103個CD133+細胞就可以在裸鼠皮下形成腫瘤，所有CD133+細胞接種處均成瘤;而colo205細胞需接種105個才能在第35天形成腫瘤，共有2只裸鼠成瘤;所有CD133-細胞接種處均未見腫瘤生長（圖2）。CD133+細胞內成瘤能力強于CD133-細胞及colo205細胞，有明顯差異，Plt;0.05;而CD133-及colo205細胞間成瘤能力無明顯差異。

2.2 大腸癌Colo205來源細胞群轉移相關基因表達變化

依據所有樣本與參考基因組比對的結果，以FDRlt;0.05為顯著差異基因/轉錄本篩選條件，利用分析軟件Tophat及Cuffdiff分別轉錄本測序常規數據分析結果表明本次測序所有樣品的FPKM分布差異不顯著。

將Illumina平臺測得CD133+、CD133-與未分選細胞基因序列與人參考基因對比后分別得到12915738、16118258及19304605條序列。依據這些序列計算每個基因在三種細胞中的FPKM值，以該值作為基因在該細胞中的表達量，3種細胞癌癥轉移相關基因的表達進行差異顯著性分析發現：CD133+細胞與未分選的colo205細胞相比，有9個基因表達明顯上調，3個基因表達明顯下調，2個基因表達變化不大;CD133-細胞與未分選的colo205細胞比較的有10個基因表達明顯上調，4個基因表達明顯下調。CD133+細胞較CD133-細胞差異表達基因中有2個基因表達明顯上調，個基因表達明顯下調，10個基因表達變化不大。

3. 討論

磁珠分選腫瘤干細胞最重要的是確定腫瘤干細胞的表面標志物，目前運用于大腸癌干細胞的標志物有CDl33、CDl66[16]、CD44[17]等。其中CDl33最具有爭議性。比如O’Brien [5]等研究顯示：在大腸癌細胞中成瘤的細胞均為CD133+，但不是所有的CD133+細胞都可能導致腫瘤的生成，由此認為不是所有的CD133+細胞都是大腸癌干細胞。雖然目前對CD133做為大腸癌的表面標志物，必須結合細胞亞群做成瘤性鑒定[5-11]，如成瘤能力強的細胞亞群能夠能在無血清培養基中成球生長并增殖，且形成的腫瘤細胞球能在血清誘導下則貼壁分化，并能在在裸鼠體內形成腫瘤[12-17]。

為了篩選與大腸癌診斷密切且相關的基因，本研究對裸鼠成立驗證的磁珠篩選的colo205來源的不同細胞群進行表達譜測序分析，并利用定量PCR技術對隨機選取的兩個鋅指蛋白表達進行驗證，結果這兩個基因的表達變化趨勢與表達譜測序結果一致（如基因p53 在CD133+/ CDl33-分別為2.366和1.61，在colo205/ CDl33-分別為2.17和1.6;基因BCL11A在CD133+/ CDl33-分別為2.951067和2.25012，在CD133+/colo205分別為0.149702和0.25174）。

本文用無血清培養基懸浮培養法聯合CD133磁珠分選法能獲得不同Colo205來源細胞群經過裸鼠成瘤實驗及體外分化實驗鑒定表明CD133+細胞具大腸癌干細胞自我更新、分化及裸鼠成瘤特性，說明無血清培養法聯合磁珠分選法是分離、純化大腸癌始動細胞是一種行之有效的方法。我們用RNA-seq研究了腸癌轉移基因表達變化，共有14個大腸癌轉移相關的基因的表達水平發生改變，可為腫瘤分類與分型的基因標記物以及藥物治療潛在靶點的發現，深入理解大腸癌腫瘤的發生機制，以及大腸癌的臨床治療提供依據。

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