葡萄NAC轉錄因子的生物信息學分析

摘 要：NAC基因家族是高等植物所特有的一類轉錄因子家族，廣泛參與植物生長發育、逆境脅迫應答等反應。通過對71種葡萄NAC蛋白與22種其他物種NAC蛋白的生物信息學分析，對與非生物逆境脅迫相關的12種NAC蛋白的染色體定位、理化性質、親/疏水性、二級結構及亞細胞定位等進行了分析和預測。結果顯示，葡萄NAC蛋白共分為5大類，與非生物逆境相關的NAC蛋白聚集在第Ⅲ類。分析顯示不同NAC蛋白間氨基酸、疏水性及穩定性之間存在一定差異，二級結構主要為隨機卷曲等。分析結果可為進一步研究通過葡萄NAC基因調控葡萄的生長與抗逆機制提供參考。

關鍵詞：葡萄；非生物脅迫；NAC轉錄因子；生物信息學

中圖分類號： 5663.1 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.05.008

提高葡萄對非生物脅迫的耐受性對提高葡萄的產量具有重要作用。很多轉錄因子在改進植物脅迫耐受性方面發揮著重要作用[1-2]。NAC轉錄因子是植物特有的一類蛋白家族，諸多研究顯示[3-5]，NAC家族成員能夠激活非生物脅迫相應基因，提高植物對非生物脅迫的耐受性[6-7]。Fang等[8]系統地分析了水稻中的140個NAC或NAC類基因，并將其劃分為5大組，逆境脅迫相關的NAC聚在第3組。本研究利用生物信息學的方法從葡萄基因組水平上對NAC基因家族進行分類，并對與非生物脅迫相關的NAC基因進行了分析，為進一步研究葡萄NAC類轉錄因子提供依據。

1 材料和方法

1.1 材 料

通過北京大學植物轉錄因子數據庫（TFDB， http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）獲得其中收錄的71條葡萄NAC基因，依次命名為VvNAC1-71。通過美國生物信息技術中心（NCBI，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索相應資料。獲得已發表的其它物種的NAC蛋白作為參考標準，包括16種逆境脅迫基因（ATAF1， CsNAC， GmNAC2， RD26， ANAC055， ANAC019， AhNAC2， AhNAC3， AmNAC1， SsNAC23， SNAC1， SNAC2， TaNAC3， ZmNAC1， OsNAC6， StNAC）和6種生長發育相關基因（OsNAC7， NAC1， CUC3 NAM， GRAB2， NAC2）。

1.2 方 法

1.2.1 NAC蛋白氨基酸序列比對及系統發生樹構建 利用clustal軟件進行氨基酸多重序列比對，利用MEGA4中遺傳距離建樹法的相鄰鏈接法（NJ）進行建樹，對生成的進化樹進行Bootstrap（自引導）校正，生成系統發生樹。

1.2.2 NAC基因結構分析及染色體定位 通過葡萄基因組數據庫（http：//www.phytozome.net/cgi-bin/gbrowse/grape）進行染色體定位，在NCBI數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）中搜索保守結構域。

1.2.3 NAC基因一級結構及理化性質分析 利用ExPaSy提供的ProtParam程序（http：//web.expasy.org/protparam/）進行理化性質分析。利用ProtScale程序（http：//us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）對翻譯后的氨基酸序列做疏水性分析。磷酸化和去磷酸化是細胞內信號傳導的重要方式，利用NetPhos2.0 Server程序（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）做磷酸化位點分析，對蛋白序列中的絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）3種氨基酸殘基可能形成的磷酸化位點作出預測。

1.2.4 二級結構分析及亞細胞定位 運用PBIL LYON-GERLAND信息庫（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa automat.pl page=/NPSA/npsa_hnn.html）對蛋白質序列進行二級結構預測（Secondary structure prediction）。通過WoLF PSORT工具（http：//wolfpsort.seq.cbrc.jp/）基于其氨基酸序列預測蛋白質亞細胞定位點。

2 結果與分析

2.1 系統發生樹

通過系統進化分析，葡萄NAC轉錄因子家族共分5個大類（圖1），每大類也各有不同。第Ⅰ大類包含17個葡萄NAC基因，在6種發育相關的NAC基因中，除擬南芥NAC2[9]基因位于第Ⅵ大類外全部位于第Ⅰ大類，推斷第Ⅰ大類NAC基因與葡萄的生長發育相關。非生物逆境脅迫相關NAC基因全部位于第Ⅲ大類，位于此類的葡萄NAC基因共有12個，其中VvNAC45與VvNAC56兩個基因同源性相對較低。其余NAC基因位于第Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ大類。其中第Ⅳ大類NAC基因數量最多。推測擬南芥NAC2基因位于第Ⅳ大類的原因可能是其序列特異性不強或參與逆境與發育兩種生命活動。

2.2 基因結構分析及染色體定位

葡萄71個NAC基因在染色體上數量分布不均勻，其中第5、第9號染色體未找到NAC基因。位于第19號染色體上的NAC基因數量最多（19個）。非生物脅迫相關NAC基因散亂分布在1、4、6、7、8、12、18、19共8條染色體上，未表現出集中性，VvNAC3基因未能定位到染色體上。葡萄的NAC基因N端都具有NAC保守結構域。

2.3 一級結構及理化性質分析

磷酸化位點分析顯示，葡萄非生物逆境脅迫相關NAC蛋白中絲氨酸磷酸化位點最多，酪氨酸磷酸化位點次之。通過ProtParam程序進行理化性質分析，結果顯示非逆境脅迫相關NAC蛋白既有酸性氨基酸，又有堿性氨基酸。從蛋白質穩定性上看，VvNAC26，VvNAC 42，VvNAC45為穩定蛋白，其余均為不穩定蛋白（表1）。

2.4 二級結構分析及亞細胞定位

在線二級結構預測結果顯示，非生物逆境脅迫NAC蛋白中隨機卷曲的比例很高（58.59%～70.35%），它起著鏈接其他二級結構原件的作用。此外，主要的二級結構原件為α螺旋（14.07%～30.81%）和延伸鏈（9.89%～20.83%），主要位于α螺旋和隨機卷曲之間。在線WOLF PSORT對蛋白亞細胞定位預測顯示，非生物脅迫相關NAC蛋白全部定位于細胞核。

3 結論與討論

對葡萄71種NAC蛋白進行了系統發生樹構建，染色體定位、理化性質分析，二級結構預測及亞細胞定位等方面的分析。系統發生樹顯示，所有的非生物逆境脅迫相關NAC蛋白都聚為一類，這與其他NAC類蛋白的研究結果相符合[10-11]，也暗示在NAC家族成員中，脅迫相應NAC類轉錄因子之間具有密切聯系。非生物脅迫相關NAC蛋白全部定位于細胞核。由此推斷，具有相近生物學功能的NAC蛋白更可能定位于相同的亞細胞結構，這與其發揮特定生物學功能密切相關。非生物逆境脅迫類NAC蛋白既有其共同點也有不同點，這些分析與研究結果，有助于對葡萄NAC基因調控葡萄的生長與抗逆機制開展進一步研究。

參考文獻：

[1] Haake V， Cook D， Riechmannjl， et al.Transcription factor CBF4 is a regulator of drought adaptation in Arabidopsis [J]. Plant Physiology，2002，130（2）：639.

[2] Abeh， Yamaguchi-shinozaki K， Urao T， et al. Role of Arabidopsis MYC and MYB homologs in drought and abscisic acid—regulated gene expression [J]. The Plant Cell Online， 1997，9（10）：1859.

[3] Nuruzzaman M， Manimekalai R， Sharoni A M， et al. Genome-wide analysis of NAC transcription factor family in rice[J]. Gene，2010， 465：30-44.

[4] Kazuo N， Hironori T， Junya M， et al. NAC transcription factors in plant abiotic stress responses[J]. Biochimica et Biophysica Acta， 2012， 1 819：97-103.

[5] Wang N， Zheng Y， Xin H P， et al. Comprehensive analysis of NAC domain transcription factor gene family in Vitis vinifera[J]. Plant Cell Rep，2013，32：61-75.

[6] Fujita M， Fujita Y， Maruyama K， et al. A dehydration—induced NAC protein.RD26，is involved in a novel ABA dependent tress—signaling pathway [J]. The Plant Journal， 2004， 39（6）：863-876.

[7] Tranlsp， Nakashima K. Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress-inducible NAC transcription factors that bind to a drought-responsive cis-element in the early responsive to dehydration stress 1 promoter [J]. The Plant Cell Online， 2004，16（9）：2 481.

[8] Fang Y， You J， Xie K， et al. Systematic sequence analysis and identification of tissue-specific or stress-responsive genes of NAC transcription factor family in rice[J]. Molecular Genetics and Genomics，2008， 280（6）：547-563.

[9] He X J， Mu R L， Cao W H， et al. AtNAC2， a transcription factor downstream of ethylene and auxin signaling pathways， is involved in salt stress response and lateral root development[J]. The Plant Journal ，2005， 44： 903-916.

[10] Ooka H，Satoh K，Dol K， et al.Comprehensive analysis of NAC family genes in Oryza sativa and Arabidopsis thaliana [J]. DNA Research， 2003，10（6）：239.

[11] Nuruzzaman M， Manimekalai R， Sharoni A M， et al.Genome-wide analysis of NAC transcription factor family in rice[J]. Gene，2010， 465（1/2）：30-44.