3α—HSD單克隆抗體的制備及其鑒定

摘 要：為制備抗3α-HSD蛋白單克隆抗體（MAb），以已表達純化的高純度3α-HSD 蛋白作為免疫原免疫BALB/c小鼠，利用雜交瘤技術，經過免疫和細胞融合后篩選出特異性的抗3α-HSD蛋白單克隆抗體，成功凍存35株IgG類型陽性雜交瘤細胞株。對14號和20號Anti- 3α-HSD進行親和性測試，發現其與可溶性抗原蛋白的親和常數分別為3.7E+09和4.2E+09，二者可與抗原牢固結合，具有良好的親和性。

關鍵詞：3α-HSD；單克隆抗體；制備；鑒定

中圖分類號：R392.11 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.05.0074

睪丸酮叢毛單胞菌在含有類固醇的培養基上或環境中存在類固醇底物誘導時，可產生多種類固醇脫氫酶和11種降解酶，其中3α-HSD（3α-hydroxysteroid dehydrogenase， 3α-HSD）是一種能夠利用分解甾體類和多環芳烴類化合物來獲取菌體生長所需要的碳源和能源的關鍵酶。3α-HSD的中文全稱是3α羥基類固醇脫氫酶，目前認為，3α-HSD不僅是睪丸酮叢毛單胞菌在以類固醇為唯一碳源時產生的一種醇脫氫酶，也是降解類固醇的關鍵酶，廣泛地存在于原核和真核生物體內，是人體調節性激素代謝水平的重要物質[1-4]。

在睪丸酮叢毛單胞菌降解甾醇類化合物類固醇的過程中，隨著甾體類激素等誘導劑濃度的提高，3α-HSD的翻譯表達量相應提高，在一定范圍內與甾體類激素含量形成了線性關系[5]。基于這種間接的線性關系，可利用3α-HSD單克隆抗體，實現對環境或食品飼料樣品中睪丸酮或類固醇類激素的準確定性以及定量檢測。研制3α-HSD單克隆抗體，可推動這種新型甾體激素檢測方法更為廣泛地用于監測環境中甾體激素污染的整體情況，以及食物、飼料中類固醇類有害成分的快速初篩。目前，國內外尚無針對睪丸酮叢毛單胞菌3α-HSD酶蛋白單克隆抗體制備的報道，本研究利用已表達純化的高純度3α-HSD 蛋白，通過免疫技術和細胞融合技術，制備其單克隆抗體，為建立甾體類激素的快速檢測方法及睪丸酮叢毛單胞菌降解類固醇類物質的機理研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與試劑

IMDM培養基、IMDM完全培養基（含15%血清）、新生牛血清為實驗室保存；2.2%甲基纖維素（貨號：M0262-100G）、HAT（貨號：H0262-10V）、HT（貨號：H0137-10VL）購自SIGMA公司；PEG1500購自Roche公司（貨號：78364）；標記山羊抗小鼠IgG/HRP購自中杉金橋公司（貨號：72324）；二篩和三篩所用包被抗體和各型亞類二抗抗體試劑購自Southern Biotech公司。標準分子質量蛋白質購自上海麗珠東風生物技術有限公司。6～8周齡雌性BSPF級Balb/c雌性小鼠購自北京華大基因公司。

1.2 方 法

1.2.1 抗原檢測 對課題組已原核表達和純化的睪丸酮叢毛單胞菌3α-HSD融合蛋白進行SDS-PAGE質控檢測，電泳條件為丙烯酰胺12%；濃縮膠恒壓80 V；分離膠恒壓100 V；考馬斯亮蘭染色60 min；脫色30 min后觀察檢測結果。

1.2.2 免疫 選用4只BALB/c雌性小鼠， 8周齡，20 g左右。用通過質控的3α-HSD融合蛋白，每只小鼠按60 μg蛋白的量，皮下初次免疫4只SPF Balb/c雌性小鼠，編號為：1，2， 3，4。14 d后，皮下第1次加強免疫，免疫量為30 μg·只-1。28 d后，皮下第2次加強免疫，免疫量為30 μg·只-1。42 d后，皮下第3次加強免疫，免疫量為30 μg·只-1。50 d后，眼眶取血，測多抗血清效價。

1.2.3 效價檢測 將抗原蛋白溶于2 g·mL-1醋酸鹽包被緩沖液，4 ℃包被過夜；1%BSA， 37 ℃封閉2 h；多抗血清從200倍開始2倍梯度稀釋，空白對照（blank）為PBS，陰性對照（negative）為陰性血清200倍稀釋。用分光光度計讀取OD值，選取效價最高的小鼠進行融合試驗60 d。

1.2.4 細胞融合 將狀態良好的sp2/0細胞與末次免疫后3 d所取的小鼠脾細胞進行融合， 融合方法采用PEG法。將狀態良好的sp2/0細胞輕柔地從培養瓶壁上吹打下來，吸入到50 mL離心管中。小鼠摘眼球取血，然后拉頸處死，放入75%的酒精中浸泡5 min。在平皿中倒入少量無血清的IMDM，將細胞篩及注射器內芯放入平皿中。用剪刀和鑷子取下小鼠的脾臟，放到細胞篩上。用注射器的內芯輕輕地將脾充分碾碎，將碾好的細胞吸入到裝sp2/0的離心管中，1 500 r·min-1離心5 min。用剪刀和鑷子取下小鼠的胸腺，碾碎。將碾好的胸腺細胞到15 mL離心管中，再加入1 mL的HAT，放在孵箱中備用。將離心好的細胞，倒掉上清，用無血清的IMDM將細胞小心輕柔地吹勻，離心（1 500 r·min-1，5 min）。將離心好的細胞上清盡量倒掉。拍打離心管底以充分懸浮細胞，將離心管放入37 ℃溫水中，在1 min內緩慢加入1 mL的PEG，加完后，在溫水中靜置1 min。然后2 min內緩慢加入2 mL的無血清的IMDM，接著2 min內緩慢加入8 mL無血清的IMDM。1 000 r·min-1離心5 min。倒掉上清，加入10 mL的血清，小心地將細胞吹勻，倒入前面準備好的胸腺細胞。再加入25 mL滅過菌的半固體培養基，充分混勻。然后均勻倒入30個細胞培養皿中。將細胞培養皿放入濕盒中，然后放入孵箱中培養。挑單克隆：挑10×93個細胞單克隆，培養于96孔細胞培養板（事先用胸腺細胞鋪板，100 μL·孔-1）。

1.2.5 細胞篩選 單克隆細胞第1次篩選：篩選用試劑主要包括：包被液，碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，pH值9.6；PBS緩沖液，pH值7.4；封閉液，1%BSA in PBS；洗液，PBS-T（0.05%吐溫，PBS）；顯色液，1%A液+10%B液（A液，1%TMB in DMSO； B液，0.1% H2O2 in 檸檬酸緩沖液）；終止液，2 mol·L-1硫酸；二抗，山羊抗小鼠IgG/HRP。

具體篩選流程包括以下步驟：用包被液稀釋3α-HSD，終濃度為10 μg·mL-1，100 ·L·孔-1，4 ℃，過夜，后用洗液洗滌2次。1%BSA封閉液封閉，200 μL·孔-1，37 ℃孵箱，2 h；后用洗液洗滌1次。加入一抗（細胞培養上清）、陰性對照（sp2/0培養上清）、空白對照（PBS）、陽性對照（陽性血清PBS 200倍稀釋），均為100 μL·孔-1，37 ℃孵箱，1 h；后用洗液洗滌3次。加入PBS稀釋20 000倍的二抗，100 μL·孔-1，37 ℃孵箱，1 h；取出后用洗液洗滌3次。顯色，顯色液100 μL·孔-1，顯色時間為5 min左右。每孔加入50 μL終止液終止。雙波長（450，603）測吸光值，記錄保存數據。

單克隆細胞第2次篩選：單克隆細胞標簽篩選，將一篩得到的陽性細胞株，載體蛋白包板，同時篩IgG，采用ELISA方法，得到二篩陽性雜交瘤細胞株。

單克隆細胞第3次篩選：主要試劑包括，包被抗體（Southern Biotech）；封閉液，2%BSA+3%蔗糖 in PBS；顯色液， 0.2 mL A液+ 10 μL30% H2O2 in 10 mL B液（A液，15 mg·mL-1 ABTS in H2O； B液，檸檬酸緩沖液，pH值4.0）；各型亞類二抗（Southern Biotech）。將篩選出來的二篩陽性細胞株進行3篩鑒定，最后得到三篩陽性雜交瘤細胞株。

1.2.6 單克隆細胞亞類鑒定 將經3次篩選出來的陽性細胞株進行亞類鑒定，主要試劑包括：包被抗體（Southern Biotech ）；封閉液，2%BSA+3%蔗糖 in PBS；顯色液，0.2 mL A液+ 10 μL 30% H2O2 in 10 mL B液（A液，15 mg·mL-1 ABTS in H2O； B液，檸檬酸緩沖液，pH值4.0）；各型亞類二抗（Southern Biotech）。具體鑒定步驟如下：用100 mmoL·L-1 PBS（pH值7.4）稀釋包被抗體至0.5 μg·mL-1，每孔加0.1 mL， 4 ℃，過夜。PBS-T洗2次，每孔加入200 μL封閉液，37 ℃孵育2 h。PBS-T洗3次；每孔加入100 μL雜交瘤上清，37 ℃孵育1 h。PBS-T洗3次；用封閉液1∶1 000（κ，λ）或1∶2 000（其它的）稀釋的HRP標記的抗體0.1 mL每孔，分別加入適當的孔中，37 ℃孵育1 h。PBS-T洗3次；每孔加50 μL底物溶液，10～20 min內于雙波長（450，603）測吸光值，記錄保存數據。

1.2.7 抗體的純化及檢測 采用Protein A/G親和純化，先用PBS平衡柱子，上樣（按1∶10的比例用PBS稀釋的腹水），用PBS洗雜，再用甘氨酸緩沖液（pH值2.9）洗脫，收集洗脫峰，用SDS-PAGE分析。紫外分光光度計檢測抗體濃度，SDS-PAGE檢測抗體純度。

1.2.8 ELISA檢測抗體親和力 將原核表達的3α-HSD蛋白樣品，以MAb （1∶2 000）為一抗，HRP-IgG為二抗（1∶2 000）進行ELISA檢測。

2 結果與分析

2.1 抗原檢測

對課題組已研制的高純度3α-HSD蛋白樣品進行質控檢測，電泳圖譜顯示其分子量為26 kD與課題組已發表文章中的數據一致（圖1），其純度大于90%，濃度為0.5 mg·mL-1（表1），說明蛋白在運輸及傳遞和保存過程中并未出現明顯降解情況，其純度和濃度條件均符合單克隆抗體制備要求。

2.2 免疫及效價檢測

利用分光光度計檢測各個稀釋倍數的OD值，具體數值見表2，經計算后可得到1、2、3、4號小鼠的效價分別為25 600，128 000，25 600，12 800。其所對應的OD值分別為0.934，0.932，0.853，0.760，比較后可以發現，1號和3號小鼠效價相同均為25 600，高于2號和4號小鼠的效價，而1號的OD值最高。另外，根據圖2可以看出，1號小鼠的多抗血清在大部分稀釋倍數時其OD值普遍高于其他3者，是較為理想的基礎材料，所以經綜合比較，選擇1號作為融合實驗的細胞。

2.3 細胞融合及篩選結果

融合前，用3α-HSD50 μg，腹腔沖擊免疫1#鼠。將融合后的細胞轉到半固體培養基中培養。將半固體培養基上生長的單克隆挑到96孔培養板中進行培養和后續篩選。

2.3.1 第1次單克隆細胞標簽篩選 用3α-HSD包板，對挑選的克隆采用ELISA方法，做第1次篩選，得到95株陽性雜交瘤細胞株。

2.3.2 第2次單克隆細胞標簽篩選 將95株陽性的細胞株，載體蛋白包板，同時篩IgG，采用ELISA方法，做第2次篩選，得到39株陽性雜交瘤細胞株。

2.3.3 第3次單克隆細胞標簽篩選 將篩選出來的50株陽性細胞株進行3篩鑒定，最后得到39株IgG類型的陽性雜交瘤細胞株（表3）。

2.4 單克隆細胞亞類鑒定

將篩選出來的39株陽性細胞株進行亞類鑒定，最后得到38株IgG類型的陽性雜交瘤細胞株。編號數值前帶“+”的為IgG亞類細胞株，均轉到6孔板擴大培養，收集上清并凍存。最后，經檢測，共成功凍存35株陽性雜交瘤細胞株。

2.5 抗體純化及檢測結果

單克隆抗體經Protein A/G親和純化后，收集洗脫樣品。利用紫外分光光度計檢測抗體濃度，利用SDS-PAGE檢測抗體純度。結果顯示（表4，圖3），14號Anti- 3α-HSD和20號Anti- 3α-HSD的純度全部大于90%，濃度分別達到4.37 mg·mL-1和2.88 mg·mL-1。

2.6 抗體親和力（親和常數）檢測

將原核表達的3α-HSD蛋白樣品，以MAb （1∶2 000）為一抗，HRP-IgG為二抗（1∶2 000）進行ELISA檢測，結果如圖4。14號Anti- 3α-HSD和20號Anti- 3α-HSD與可溶性抗原蛋白的親和常數分別為3.7E+09和4.2E+09，二者可與抗原牢固結合，具有良好的親和性和均一性，可用于3α-HSD蛋白及攜有抗原3α-HSD蛋白成分的樣品免疫檢測。

3 結論與討論

在睪丸酮叢毛單胞菌降解甾醇類化合物類固醇的過程中，甾體類誘導劑的加入可全面抑制阻遏蛋白Rep B和3α-HSD基因mRNA的結合及Rep A與順式操縱子雙位點的結合，從而促進3α-HSD基因的表達和翻譯過程的順利進行。隨著甾體類激素等誘導劑濃度的提高，阻遏蛋白的被抑制程度也隨之增加，而3α-HSD的翻譯表達量相應提高，在一定范圍內與甾體類激素含量形成了線性關系。研究人員利用3α-HSD單克隆抗體，以C. testosterone作為檢測環境中載體類化合物的指示菌種，以3-HSD為目標蛋白建立了環境或食品中總甾體激素含量的雙抗夾心酶聯免疫反應（ ELISA）[6-7]。雙抗夾心ELISA法具有操作簡便、靈敏度高和通亮高等特點，可以同時檢測睪丸酮及與其結構類似的一類物質的量，可用于監測環境中甾體激素污染的整體情況和食物、飼料中類固醇類有害成分的快速初篩。此次3α-HSD單克隆抗體的研制成功將為這種新型甾體激素檢測方法的進一步研究和推廣應用奠定基礎。

參考文獻：

[1] Boyer J， Baron D N， Talaly P. Purification and properties of 3α-hydroxysteroid dehydrogenase[J].Biochemistry， 1965， 4 （19） ： 1 825-1 833.

[2] Mobus E， Maser E. Molecular cloning， overexpression and characterization of steroid-inducible 3α-hsdroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase from Comamonas testosterone，a novel member of the short-chain dehydrogenase/reductase superfamily[J]. J Biol Chem，1998，273 （473）：30 888-30 896.

[3] Xiong G， Martin H J， Blum A， et al. A model on the regulation of 3α-hsdroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase expression from Comamonas testosterone[J].J Biol Chen，276（130/132）：961-970.

[4] 弓玉紅，郝林，郭凱凱.1株苯并[a]芘高效降解菌的分離鑒定[J].山西農業科學，2012（5）：490-492.

[5] Mobus E，Jahn M，Schmid R，et a1. Testosterone-regulated expression of enzymes involved in steroid and aromatic hydrocarbon catabolism in comamonas testosteroni[J]. J Bacteriol， 1997，179（18）：5 951-5 955.

[6] Yu Y H，Diao Y W，Ma D Z，et a1. Expression and contection of 3-HSD in different bacteria by the induction of testosterone[J]. Journal of Changchun University of Science and Technology：Natural Science Edition，2007，30（4）：63-65.

[7] Ma D Z，Diao Y W， Yang J X，et a1. ELISA detection of steroidal hormones in water resources，food and feed[J]. Chinese Journal of Applied Chemistry， 2010，27（12）：1 466-1 469.