宿根婆婆納‘達爾文之藍’的組培脫毒和快繁技術

摘 要：將供試品種的帶莖尖和腋芽的莖段，用70%酒精浸泡30 s，然后用20%的次氯酸鈉溶液浸泡30 min，無菌水沖洗4次，消毒處理后剝取0.1～0.3 mm的莖尖，接種于以MS為基本培養基添加6-BA、IAA、NAA等外源激素的培養基中，研究了不同條件對愈傷組織誘導芽形成和芽繼代增殖、生根和移栽效果的影響。結果表明，以MS為基本培養基，添加6-BA 1.0 mg·L-1和IAA0.5 mg·L-1為較適宜的外植體誘導愈傷組織和愈傷組織誘導芽的培養基。最佳繼代增殖培養基為6-BA2.0 mg·L-1和NAA0.1 mg·L-1。最佳生根培養基為1/2MS添加NAA0.2 mg·L-1和IAA1.0 mg·L-1。25 d后，組培苗移栽成活率達到98%以上。

關鍵詞：宿根花卉；莖尖剝離；愈傷組織；芽誘導；玻璃化

中圖分類號：S336 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.05.009

婆婆納‘達爾文之藍’（Veronica'Darwin's Blue'）為玄參科婆婆納屬多年生草本植物，株高30～35 cm，花期5～10月，藍色花，是近幾年從國外引進，適宜我國北方地區的優良宿根花卉，耐寒、耐旱及瘠薄土壤[1-3]，主要用于園林綠化中布置花壇、花境，以彌補夏秋季花卉稀少的現狀，主要通過常規的無性扦插和分株方式來繁殖。但在栽培繁殖過程中發現，隨著繁殖次數和栽植年限的增加，出現了植株的長勢和花的品質越來越差的嚴重退化現象[4-7]，從而使繁殖率大大降低，很難滿足市場供應，甚至一物難求。針對此問題，可利用植物組織培養技術，進行脫毒復壯和快速繁殖，以提供大量優質種苗，但目前關于宿根婆婆納‘達爾文之藍’和同屬品種的莖尖剝離組織培養及脫毒復壯快繁技術尚未見報道。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 外植體 以帶莖尖和腋芽的莖段為材料，由北京花木有限公司宿根花卉基地提供。

1.1.2 培養基 以MS為基本培養基，添加不同種類和不同濃度水平的外源激素[8-9]， 愈傷組織和叢生芽誘導、增殖培養基添加綿白糖30 g·L-1，瓊脂粉4.5 g·L-1；生根培養基添加綿白糖20 g·L-1，瓊脂粉5.0 g·L-1。各培養基均為pH值5.8～6.0，121 ℃下，高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 培養條件 光照強度3 000 lx，光照時間12 h，溫度（24±2） ℃。增殖和生根培養與此相同。

1.2 方 法

取宿根婆婆納‘達爾文之藍’帶莖尖和腋芽的幼嫩莖段，長2～3 cm，剪去葉片，用柔軟的毛刷蘸取洗衣粉水輕輕刷洗干凈，用流水沖洗0.5～1 h。在超凈工作臺上，用70%的酒精浸泡30 s，再用20%的次氯酸鈉溶液浸泡20 min，用無菌水沖洗4次，待用。

1.2.1 莖尖剝離誘導愈傷組織和叢生芽 在超凈工作臺上，將已消毒的外植體材料在生物解剖鏡下，剝取0.1～0.3 mm大小的莖尖[10]，接種于培養基上：①6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1；②6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1；③6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1； ④6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1； ⑤6-BA1.0 mg·L-1+IAA0.5 mg·L-1；⑥6-BA1.0 mg·L-1+IAA1.0 mg·L-1；⑦6-BA2.0 mg·L-1+IAA0.5 mg·L-1；⑧6-BA2.0 mg·L-1+IAA1.0 mg·L-1。每瓶培養基接1個莖尖，每種培養基20個重復，共160瓶。培養30 d時，觀察記錄結果。

1.2.2 繼代增殖培養 將莖尖誘導所得叢生芽剪切成2 cm左右帶2～3個腋芽的段，接種到增殖培養基上：①6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1；②6-BA1.0 mg·L-1+IAA0.5 mg·L-1；③6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1；④6-BA2.0 mg·L-1+IAA1.0 mg·L-1。每種培養基接種5瓶，每瓶8株，30 d觀察記錄結果。

1.2.3 生根培養 將株高2～3 cm帶有4～6個葉片的無根壯苗，轉接到以1/2MS為基本培養基，添加①NAA0.2 mg·L-1， ②NAA0.2 mg·L-1+IAA1.0 mg·L-1，③NAA0.4 mg·L-1，④NAA0.4 mg·L-1 +IAA1.0 mg·L-1的生根培養基上，每種培養基接種5瓶，每瓶15株，進行生根培養，20 d觀察統計結果。

1.2.4 移栽煉苗 將培養20 d的生根苗移到溫室，擰松瓶蓋煉苗3～5 d，將苗從培養瓶中取出，清洗干凈根部的培養基，栽到裝有基質（優質草炭+蛭石+珍珠巖=3∶1∶1）的128孔穴盤上，25 d觀察統計結果。

2 結果與分析

2.1 愈傷組織和叢生芽的誘導

在宿根婆婆納‘達爾文之藍’的莖尖誘導愈傷組織和叢生芽的過程中，發現外源激素的種類及濃度對愈傷組織和芽的形成都有著不同程度的影響。細胞分裂素（即6-BA）的濃度高時，愈傷組織和芽的形成相對較多，但易造成玻璃化；生長素NAA濃度高時，不利于芽的形成和生長，玻化嚴重；生長素IAA濃度高時，有利于芽的形成和生長。具體情況見表1。

由表1中可看出，在8種添加了不同激素種類和濃度水平的培養基中，愈傷組織和芽形成的多少及百分率、玻璃化現象的存在、芽苗的株高和健壯程度都有所不同，并且存在著明顯的差異。其中以編號為⑥的培養基表現性狀最好，⑤和⑧較好，⑦次于⑤和⑧，①和③較差，②很差，④最差。

2.2 繼代增殖

繼代增殖培養基的設計，以莖尖誘導愈傷組織和芽的結果為參考依據。在繼代增殖培養過程中，發現激素種類和濃度不同對芽增殖的影響也有所不同，并且與芽誘導的結果較為一致。6-BA濃度高時有利于芽的形成，IAA濃度高時有利于苗的生長。6-BA與NAA配比時更有利于芽的增殖培養，而與IAA配比時有利于壯苗培養。具體情況見表2。

由表2可看出，編號為③的培養基增值系數最高，從整體情況來看為最好的增殖培養基；④次之，增殖系數略低一點，但苗較高壯一些，且有老化生根現象；①和②相對較差，增值系數低。

2.3 生根培養

生根培養基的設計，以增殖培養結果為參考依據。在生根培養過程中，發現激素種類和濃度對根的形成有著很大影響。單獨使用NAA時，不利于根的形成，且當NAA濃度增高時，苗基部產生較多愈傷組織，使根的形成嚴重受阻；當將NAA與IAA結合使用時，情況較好。具體情況見表3。

由表3可看出，編號為②的培養基中生根情況最好，生根率達到100%，根的數量較多，苗基部產生的愈傷組織很少，有利于移栽成活。①和④較差，生根率相對較低，根的數量也相對較少，不利于移栽成活。③最差，生根率不到半數，根數少且苗基部愈傷組織形成較多，很不利于移栽成活。

2.4 移栽煉苗

宿根婆婆納‘達爾文之藍’的生根苗在移栽25 d時根已滿穴，株高10 cm左右，苗健壯有分枝形成，成活率達到98%以上。

3 討 論

3.1 玻璃化現象形成的影響因素

在增殖培養過程中發現，當溫度升高時，易形成玻璃化苗，尤其當溫度高于24 ℃時，隨著溫度的升高玻璃化苗的數量明顯增多；當溫度降低時，玻璃化現象減少或無?；?，但苗的生長緩慢。另外，在相同溫度條件下，當細胞分裂素6-BA和生長素NAA的濃度增加時，易形成玻璃化苗。當兩種因素同時存在時，玻璃化現象加重。玻璃化程度較輕時，在溫度條件適宜時會恢復成好苗；而玻璃化嚴重時，無法恢復，會慢慢褐化死亡。玻璃化苗的產生，使苗增殖擴繁和生根培養的數量與質量都受到影響。尤其是在大量擴繁生產時，應注意避免玻璃化苗的形成，以提高苗的生根率和質量，有效降低成本。

3.2 影響生根率和根數量的因素分析

在生根培養過程中發現，除了激素影響苗的生根率和根的數量外，苗的老幼程度和是否玻璃化也影響生根率和根的數量。苗越大，越易生根，根的數量和生根率都較高；反之，相對較低。玻璃化苗不易生根，甚至不生根。在大量生產時，在生根培養前，根據苗的生長狀況，可進行一次壯苗培養，壯苗培養基中的激素濃度可適當降低一些，這樣有利于提高生根率和縮短生根培養時間，有效降低成本。

3.3 莖尖培養脫毒效果的分析

婆婆納‘達爾文之藍’在常規無性繁殖栽培過程中，出現了退化現象，其表現癥狀為：葉皺縮，分枝減少，植株矮小，花量減少，花期短，植株枯死。此退化現象嚴重地影響了其觀賞性和栽培繁殖。經莖尖剝離培養出的芽苗，葉片恢復正常，移栽后很快形成分枝，達到了脫毒壯苗的效果。但由于各種因素，未進行專業的病毒檢測工作。

4 結 論

綜上所述，莖尖剝離誘導愈傷組織和芽形成的最佳培養基為MS+6-BA1.0 mg·L-1+IAA0.5 mg·L-1，在此培養基中芽形成的數量和苗的生長情況最好；最佳增殖培養基為MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1，在此培養基中苗的增值系數和生長情況相對優于其它3種培養基；最佳生根培養基為1/2MS+NAA0.2 mg·L-1+IAA1.0 mg·L-1，在此培養基中苗的生根率和生根數量明顯高于其它3種培養基；生根苗移栽煉苗容易成活，25 d時成活率達98%以上；適宜的培養溫度為22～24 ℃。

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