龍山卷丹百合無癥病毒的檢測

摘 要：以龍山卷丹百合的病葉作為試材，采用DAS-ELISAS檢測法對樣品進行百合無癥病毒的檢測，檢出率為58.3%；提取總RNA為模板，通過RT-PCR擴增其外殼蛋白基因，大小為287 bp，和預(yù)期條帶大小一致。經(jīng)Blast比對發(fā)現(xiàn)，該基因片段與Genbank上發(fā)表的LSV CP基因序列同源性達92%以上。

關(guān)鍵詞：卷丹百合；RT-PCR；DAS-ELISA；百合無癥病毒

中圖分類號：S682.2 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.05.006

卷丹百合是湖南省一種具有濃郁地方特色的農(nóng)產(chǎn)品，不僅具備食用和藥用雙重價值，還有較強的觀賞價值，主要分布于湘西州龍山縣、邵陽市隆回縣和永州市東安縣，其中以龍山縣栽培歷史最為久遠，在省內(nèi)外享有很高的知名度，食用百合生產(chǎn)已經(jīng)成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶致富的特色創(chuàng)收項目之一。但長期以來，由于百合種球生產(chǎn)主要靠扦插和分球等無性繁殖方式進行，病毒感染嚴重，導(dǎo)致產(chǎn)量和質(zhì)量下降，產(chǎn)區(qū)出現(xiàn)百合植株的黃化、皺縮和畸形等衰退現(xiàn)象，給食用百合產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，嚴重影響農(nóng)戶的生產(chǎn)積極性。

到目前為止，已相繼報道對百合具有侵染性的病毒達10種以上，其中危害較為嚴重的有3種：百合無癥病毒（LSV）、黃瓜花葉病毒、郁金香碎錦病毒 [1-4]。百合無癥病毒屬于線性病毒科、香石竹潛隱病毒屬，是分布范圍最廣、危害最大的病毒之一[5]，主要通過汁液傳播，也可以通過葉片接觸或昆蟲媒介的方式傳播。由于單獨侵染百合時常使寄主表現(xiàn)為隱癥，故稱為百合無癥病毒；與其它病毒復(fù)合侵染時，會出現(xiàn)脈明、畸形、壞死斑等癥狀[6-9]。 近年來，國內(nèi)外對侵染百合的LSV有較多的研究報道[10-13]，但關(guān)于湖南龍山卷丹百合感染LSV的報道尚少。本研究通過對湖南龍山卷丹百合實地調(diào)查，采回病樣，采用血清學(xué)和RT-PCR法對卷丹百合感染LSV的情況進行檢測和鑒定，旨在為湖南龍山卷丹百合病毒檢測、病毒病的防治和無毒苗的培育提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 DAS-ELISA檢測法

1.1.1 材 料

卷丹百合樣品于2012年7月采自湖南省湘西州龍山縣百合產(chǎn)區(qū)，田間感病株呈現(xiàn)出葉脈黃化，部分葉片卷曲，植株矮縮束頂?shù)牟徽ＩL現(xiàn)象。

陽性對照（含LSV病毒樣品）和陰性對照（不含LSV病毒樣品）均購自上海卡奴生物科技有限公司的LSV DAS-ELISA檢測試劑盒。

1.1.2 方 法 稱取0.5 g新鮮百合病葉置于研缽中，加入液氮充分研磨，并轉(zhuǎn)移到裝有200 μL裂解液的1.5 mL離心管中，勻漿；4 ℃，15 000 g，離心5 min，棄沉淀，-20 ℃保存上清。病毒檢測方法參照試劑盒操作步驟進行。

1.1.3 判斷標準 酶標儀在450 nm處讀取吸收值（OD值）。結(jié)果判斷標準為：臨界值（CO）=陰性對照均值+0.15，樣品OD值<臨界值，為百合無癥病毒（LSV）陰性；樣品OD值>臨界值，為百合無癥病毒（LSV）陽性。

1.2 RT-PCR檢測法

1.2.1 材料及主要試劑 以DAS-ELISA方法檢測呈現(xiàn)陽性的百合病葉為試材，進一步進行百合無癥病毒的分子檢測。

cDNA第一鏈合成試劑盒購自北京天根生物科技有限公司；植物類病毒RNA核酸提取試劑盒購自武漢哇哇噻納技術(shù)開發(fā)有限公司；RT-PCR反應(yīng)所采用的試劑High dNTPs、10×PCR Buffer、Taq DNA多聚酶則購于上海生工生物工程有限公司；DNA凝膠純化回收試劑盒購自Vigene Biotech公司。

1.2.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù)NCBI已發(fā)表的LSV病毒的CP基因序列，設(shè)計特異性引物：上游引物p1： 5'-ACGCTGGACTGCGGA-3'，下游引物p2：3'-AAGCCAAAGGTCCGAGGG-5'，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3 總RNA的提取 稱取0.5 g新鮮的百合病葉，放置于已滅菌的研缽中，加入液氮迅速研成粉末，轉(zhuǎn)移到加有200 μL裂解液的1.5 mL去RNA酶的離心管中，勻漿，室溫靜置5 min；4 ℃，15 000 g，離心15 min，取上清液。

另取1.5 mL離心管，依次加入150 μLBinding buffer，50 μL上清，20 μL納米磁珠（MNP），混勻；70 ℃恒溫，預(yù)熱10 min，每2～3 min混勻一次；短時高速離心，去上清；加入200 μLwashing buffer I，充分混勻，去上清；加入200 μL washing buffer II，充分混勻，去上清；加入200 μL washing buffer III，充分混勻，去上清；最后加入50 μL Elution buffer，靜置3 min，-80 ℃冰箱保存上清。然后加DNA消化酶去除DNA的干擾，通過1%瓊脂凝膠和溴化乙錠（EB）染色后，進行電泳檢測[15]。

1.2.4 cDNA 第一鏈的合成 提取卷丹百合病葉的RNA，按照天根公司cDNA第一鏈合成試劑盒說明書操作步驟合成cDNA。在20 μL反應(yīng)體系中：① 5×gDNA Buffer 2 μL，Total RNA 6 μL，ddH2O 2 μL，混勻，42 ℃孵育3 min；②向①混合液中加入10×Fast RT Buffer 2 μL，RT Enzyme Mix 1μL，F(xiàn)Q-RT Primer Mix2 μL，ddH2O 5 μL，42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min，4 ℃保存。

1.2.5 PCR擴增 在50 μLRT-PCR反應(yīng)體系中：cDNA 4 μL，上游引物、下游引物各1 μL，Taq酶0.6 μL，dNTPs 6 μL，10×PCR buffer 5 μL，ddH2O 32.4 μL；PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)，再72 ℃延伸6 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，取4 μL PCR產(chǎn)物用含有溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠電泳25 min，用Gene Snap凝膠成像儀照相并分析。

另取30 μL純化PCR產(chǎn)物進行測序（南京金斯瑞生物科技有限公司進行），測得的核苷酸序列運用BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的LSV序列進行同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DAS-ELISA檢測結(jié)果

根據(jù)顯色反應(yīng)得知（圖1），在12個樣品中有7個樣品顯色為陽性，5個樣品為陰性。對酶標儀讀取的數(shù)據(jù)進行分析（表1），7個樣品的OD值大于臨界值，5個樣品OD值小于臨界值，檢出率為58.3%，這與顯色反應(yīng)的結(jié)果一致，初步確定龍山卷丹百合受到LSV的侵染。

2.2 RNA提取

取5 μL的總RNA在1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，由圖2可見，提取的總RNA有3條較清晰的條帶，且均無明顯的拖尾現(xiàn)象，其中28S和18S條帶亮度較高，5S條帶亮度較弱，說明總RNA完整性較好。從紫外分光光度計檢測得知，OD260/OD280的比值接近1.8，說明總RNA無多糖、多酚和蛋白的污染，質(zhì)量高。

2.3 RT-PCR測序結(jié)果及序列分析

以cDNA為模板，采用特異性引物進行PCR擴增，將純化的 PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳，由圖3可知，該目的條帶約為300 bp，與預(yù)期片段大小一致。

測序結(jié)果表明，LSV擴增產(chǎn)物共有287個核苷酸。通過BLAST對所獲得的LSV擴增序列與Genbank上已登錄的中國浙江和北京兩地區(qū)分離物（登錄號分別為AY620983、EF158109）核苷酸序列進行比對，同源性高達99%；與印度分離物（AJ831416）和韓國分離物（JX962776）的同源性大于92%。以上分析結(jié)果證實，龍山卷丹百合LSV擴增產(chǎn)物與其它分離物的同源性較高，從而進一步表明DAS-ELISA檢測呈陽性的百合樣品感染了百合無癥病毒。

3 結(jié)論與討論

卷丹百合是湖南龍山縣傳統(tǒng)中藥材及食用佳品，是龍山特色農(nóng)業(yè)的重要組成部分，在龍山縣已有50多年的栽培歷史，目前已形成“種植區(qū)域化，生產(chǎn)規(guī)模化，加工規(guī)范化，銷售市場化”的產(chǎn)業(yè)化格局。長期以來的無性繁殖和重土連作，種球攜帶大量病毒，導(dǎo)致種球自然退化或異化，引起品質(zhì)下降、產(chǎn)量降低等種性退化的現(xiàn)象，這給卷丹百合產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。本研究通過田間觀察、DAS-ELISA和RT-PCR檢測技術(shù)對龍山縣田間百合感染LSV的情況展開調(diào)查和檢測，確定產(chǎn)區(qū)的卷丹百合已被百合無癥病毒感染。這為今后的產(chǎn)區(qū)百合病毒病防治和無病毒苗培育奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] Ki Hyum Ryu， Hye Won Park， Jang Kyung Choi. Characterization and sequence analysis of a lily isolate of cucumber mosaic virus form lilium tsingtauense [J]. Plant Pathol J， 2002，18（2）：85-92.

[2] 孔寶華，陳海如，蔡紅.云南省花卉病毒病種類及防治對策[J].植物保護，2001，27（5）：25-26.

[3] 王繼華，霍素萍，孔寶華，等.百合無癥病毒的RT-PCR和IC-RT-PCR檢測[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，19（2）：148-150.

[4] 陳秋萍.福建省百合病害調(diào)查初報[J].福建林學(xué)院學(xué)報，2000，20（2）：162-164.

[5] 王繼華，王麗花，丁元明，等. 應(yīng)用多重RT-PCR檢測百合無癥病毒和百合斑駁病毒[J].園藝學(xué)報，2005，32（2）：284-287.

[6] Asjes C J， Blom-Barnhoorn G J， Van Schadewijk A R， et al. Effect of seasonal detection of lily symptomless virus and lily mottle virus on aphid borne virus spread in Lilium in the Netherlands [J]. Acta Horticulturae，2002，68：201-207.

[7] 洪波. 百合花卉研究綜述[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2000，2（2）：68-70.

[8] 陳臻. 百合無癥病毒RT-PCR檢測技術(shù)的研究[J].園藝學(xué)報，1993，20（3）：284-288.

[9] 楊佐琦，林俊義. 百合潛無性病毒病害之鑒定及診斷[J].植物保護學(xué)會會刊，1993，35（2）：95-103.

[10] 吳建祥，劉成科，洪健，等. 百合無癥病毒單克隆抗體的制備及檢測應(yīng)用[J].微生物學(xué)報，2005，8（4）：580-583.

[11] Hsu H T， Kim J Y， Lawson R H. Purification of lily symptomless carlavirus and detection of the virus in lilies[J]. Plant Disease，1995，79：912-916.

[12] 周云，薛寒青. 百合無癥病毒的ELISA檢測[J].青海農(nóng)林科技，2008（2）：20-21.

[13] 高雅紅，王進忠，冷平生，等. 延慶地區(qū)侵染百合的病毒檢測與序列分析[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2010，1（25）：13-15.

[14] 王發(fā)林，古勤生，劉芬，等. 蘭州百合病毒病原的DAS-ELISA檢測[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，18（4）：106-107.

[15] 袁紅梅，趙麗娟，郭文棟，等. 小黑楊花粉總RNA提取方法的比較研究[J].北方園藝，2013，3（6）：113-116.