一種珍稀野生真菌鑒定及生理指標測定

摘要：以一株野生大型真菌的子實體的基因組DNA為模板進行內轉錄間隔區（ITS）的PCR擴增、測序及系統發育分析，結果表明菌絲純培養物來源于該子實體，該真菌屬于乳菇屬（Lactarius），GenBank登錄號為KC703008，系統發育分析表明了該菌在屬內的遺傳地位。對該菌株的生理指標進行了檢測，結果表明該菌子實體中蛋白質質量分數和水溶性多糖質量分數較低，存在蛋白酶、磷酸酶和漆酶的活性，具有深入研究的價值。

關鍵詞：野生真菌；乳菇屬（Lactarius）；內轉錄間隔區（ITS）；蛋白酶；磷酸酶；漆酶

中圖分類號：Q939.5 文獻標識碼： A 文章編號：0439-8114（2014）04-0826-04

Identification of a Wild Fungus and Detections of Its Physiological Index

ZHAO Shuang1，2，3，XU Feng1，2，3，LIU Yu1，2，3，YANG Qiong1，MA Kang1，CHEN Jie1

（1.Institute of Plant and Environment Protection，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science，Beijing 100097，China；

2. Beijing Engineering Research Center for Edible Mushroom，Beijing 100097，China；

3. Key Laboratory of Urban Agriculture （North），Ministry of Agriculture，Beijing 100097，China）

Abstract： Genomic DNA of a wild fungus was extracted from its fruiting body，and used as the template for the ITS gene’s PCR. The phylogenetic analysis based on the gene sequence of ITS was conducted to confirm the genetic position of this fungi. The results showed that the gene sequences of ITS from mycelium and fruiting body were the same. Phylogenetic analysis proved that the fungi was belonged to the genus Lactarius. GenBank accession number is KC703008. The physiological index of the fungus，including the mass ratios of protein and hydrophilic polysaccharide， activities of proteinase， phosphatase and laccase were detected. It was found that the mass ratios of protein and hydrophilic polysaccharide in fruiting bodies were low， but the fungus had the activities of proteinase， phosphatase and laccase. The in-depth study of this fungus is worthwhile.

Key words： wild fungus； Lactarius； internal transcribed spacer（ITS）； proteinase； phosphatase； laccase

中國是世界生物多樣性豐富的國家之一，也是氣象和生態環境多樣的國家，蘊藏著豐富的真菌種質資源，分布著全世界已知真菌（70 000種）的1/7的種類，其中野生食藥用菌大約有1 200多種，為中國食用菌產業的持續發展提供了必需的生物資源基礎。近年來，隨著野生資源的日漸減少，生物資源保護和綜合利用成為社會關注的重點領域，因此，野生食用菌種質資源的開發利用發展成為當前食用菌學科的研究熱點之一。

乳菇屬（Lactarius）是隸屬于擔子菌門、層菌綱、傘菌目、紅菇科的真菌，多數是植物外生菌根菌，在世界范圍內廣泛分布，但大多數分布于溫帶地區。目前，全世界該屬已知約400種真菌，其中被描述的有150多種[1]。由于本屬的品種多為與植物根系共生，脫離共生樹種的根系時，菌絲培養以及子實體形成都存在很大的難度，目前都還不能人工馴化栽培[2]。近幾年的研究主要集中在對松乳菇、紅汁乳菇等品種的菌絲馴化、菌絲營養生理、發酵條件和工藝等方面的研究[3-5]，以及利用菌絲體代替子實體完成生理功效的研究及應用[6，7]。研究發現，乳菇屬中某些真菌富含多種氨基酸、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、礦物質元素、微量元素、灰分、多糖、核酸、維生素等，具有抗病毒、抗腫瘤、抗突變、抗衰老、抗氧化、降血脂的作用，是十分理想的食品與保健品[1，8，9]。

對從湖南省瀘溪叢樹林采集的一株野生菌通過內轉錄間隔區（ITS）序列進行鑒定及其系統發育分析，從而對該野生菌株的遺傳地位進行解析，并測定了該子實體的蛋白質質量分數、水溶性多糖質量分數以及蛋白酶、磷酸酶和漆酶的活性，為該野生菌的開發利用打下了基礎。

1 材料

1.1 供試材料

供試材料收集于湖南省瀘溪叢樹林，采集后經過自然風干處理，待用。

1.2 試劑

二喹啉甲酸BCA蛋白定量試劑盒購于北京博邁德科技發展有限公司。酪蛋白和4-硝基苯基磷酸二鈉（PNPP）購于美國Sigma公司。2，2′-聯氮基雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）購于美國Amresco公司。DNeasy植物試劑盒購自德國凱杰（Qiagen）公司。Ex Taq聚合酶、dNTP等分子生物學試劑均為寶生物工程（大連）有限公司產品。所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。苯酚、濃硫酸、乙醇、氯化鈉（NaCl）、氫氧化鈉（NaOH）、乙酸鈉、乙酸、葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4等化學試劑均為分析純，購于國藥集團北京化學試劑公司。

1.3 儀器

5418R小型臺式冷凍離心機、5331梯度PCR儀和移液器購自Eppendorf公司，凝膠成像系統購自美國BIO-RAD公司，電泳儀DYY-Ⅲ-12B購自北京六一儀器廠，MSC-Advantage 1.2生物安全柜購自美國Thermo公司，M200全波長多功能酶標儀購自美國TECAN公司，AR2140型精密天平購自美國奧豪斯公司，UV9100系列紫外可見分光光度計購自北京萊伯泰科儀器有限公司，水浴鍋購自北京精科華瑞儀器有限公司，TGL-16G飛鴿牌離心機購自上海安亭科學儀器廠。

1.4 培養基

2 方法

2.1 鑒定

2.1.1 DNA的提取和ITS PCR擴增 子實體標本的表面用少量75%的乙醇擦拭，直接取菌蓋部位的少量菌塊于1.5 mL的離心管中，加入少量液氮，無菌研磨至粉末狀。然后用DNeasy植物試劑盒進行DNA的提取。提取的基因組DNA經去離子水稀釋10、100倍后，作為PCR反應的模板，以ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG -3′）和ITS4（5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）為引物，進行PCR 擴增，PCR 擴增條件為：95 ℃、5 min；95 ℃、30 s，58 ℃、1 min，72 ℃、30 s，30個循環；72 ℃、10 min；降至4 ℃結束。取7～8 μL PCR樣品凝膠電泳20 min，EB染色，在凝膠成像系統中觀察提取DNA的質量并照相記錄。

2.1.2 ITS序列測定及系統發育分析 PCR產物先切膠回收后委托中美泰和生物技術（北京）有限公司測序。將菌株的ITS基因序列提交到GenBank 核酸序列數據庫并與數據庫中已知的相關序列進行比較，并用MEGA5.05構建系統發育樹。所得序列通過BLAST程序與GenBank中的ITS基因序列進行同源性比較，用MEGA5.05軟件包中的Kimura2-parameter法計算遺傳距離，用Neighbor-Joining法構建系統發育樹，重復抽樣1 000次分析系統樹各分支的置信度。

2.2 生理指標測定

2.2.1 粗蛋白或酶液樣品的制備 稱取干品子實體加入去離子水泡發4 h后，吸干子實體表面的水分，取菌蓋組織0.1 g，加入1 mL去離子水，研磨至組織破碎后， 12 000 r/min 離心10 min，取上清，即為粗蛋白或酶液樣品。

2.2.2 蛋白質質量分數的測定與標準曲線的制作 利用標準樣品牛血清白蛋白（BSA）配制成25、50、100、200、300、400 μg/mL的溶液，采用二喹啉甲酸BCA蛋白定量試劑盒制作標準曲線。將不同樣品的蛋白質提取液進行適當的梯度稀釋后采用二喹啉甲酸BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質質量分數。

2.2.3 蛋白酶活性的測定 用0.1 mol/L、pH 7.2的磷酸緩沖溶液將酪蛋白配制成10 g/L的溶液作為酶反應的底物，儲存于-20 ℃冰箱內待用。取粗酶液20 μL加入140 μL底物，在37 ℃反應15 min，加入540 μL 50 g/L三氯乙酸（TCA）終止反應，以 12 000 r/min離心5 min，取上清在波長280 nm處測量吸光度。以水浴前加入50 g/L TCA終止反應樣品作為對照。酶活力單位定義為：37 ℃下每分鐘每毫升反應體系在280 nm處產生0.001個吸光度所需的酶量。

2.2.4 磷酸酶活性的測定 用去離子水將PNPP配制成濃度為0.018 mol/L的溶液作為反應底物，避光儲存于-20 ℃冰箱內待用。取粗酶液25 μL加入275 μL去離子水，加入0.3 mL 0.1 mol/L pH 5.0的醋酸鈉緩沖溶液，再加入30 μL PNPP底物，在37 ℃反應15 min，加入300 μL 0.5 mol/L NaOH終止反應，在波長400 nm處測量吸光度，以去離子水代替酶液進行反應作為對照。酶活力單位定義為：37 ℃時每分鐘每毫克酶水解底物的微摩爾數。

2.2.5 漆酶活性的測定 取10 mg ABTS加入150 μL乙酸，用去離子水定容到30 mL，所得溶液作為反應底物，避光儲存于-20 ℃冰箱內待用。取粗酶液10 μL加入190 μL上述底物，在37 ℃反應5 min后，立即在波長400 nm處測量吸光度，以去離子水代替酶液進行反應作為對照。酶活力單位定義為：37 ℃時每分鐘每毫升反應體系在400 nm處產生1個吸光度所需要的酶量。

2.2.6 水溶性多糖含量的測定及標準曲線的制作 取子實體適量，加入4倍質量的去離子水打碎浸提過夜，在4 ℃以7 000 r/min離心20 min，取下層不溶物加入4倍質量的去離子水，于90 ℃水浴抽提3 h，稍冷卻后收集提取液，加入4倍體積的無水乙醇沉淀多糖12 h，離心收集沉淀后于80 ℃烘箱中烘至恒重，稱取一定質量的樣品制成不同濃度的樣品溶液，采用苯酚-硫酸法測定水溶性多糖的含量。以葡萄糖作為標準物制作標準曲線。

3 結果與分析

3.1 菌種鑒定結果

3.1.1 ITS PCR擴增結果 以10、100倍稀釋的基因組DNA為模板，選用ITS5和ITS4為引物，均能擴增出比較明亮的條帶，結果如圖1所示，所得產物片段大小在500、800 bp之間，與預期結果相一致。

3.1.2 系統發育分析 在NCBI網站上（http：// blast.ncbi.nlm.nih. gov/ Blast.cgi？ PROGRAM =blastn BLAST_PROGRAMS =megaBlast PAGE_TYPE= BlastSearch SHOW_DEFAULTS =onLINK_LOC=blasthome）用BLAST程序進行比對，選取相似性較高的菌株，在MEGA5.05軟件中進行系統發育樹的構建及遺傳距離的計算，以Russula xerampelina voucher AM3GB25H2菌株作為外群菌株構建系統發育樹，結果表明，該分離菌株與Lactarius deterrimus isolate UP514、L. hatsudake isolate sp 159、L. quieticolor voucher UE10.09.2004-1、L. semisanguifluus isolate 339菌株的遺傳關系最近，遺傳距離均為100%（圖2）。因此將該子實體定名為Lactarius sp. JZBHM001。

3.2 生理指標測定結果

JZBHM001的各項生理指標的測定結果見表1。通過檢測發現，JZBHM001干品子實體蛋白質質量分數和水溶性多糖質量分數都較低，分別約為0.70%和0.38%，但是從該子實體干品中檢測到了蛋白酶、磷酸酶和漆酶的活性，活性分別為491.67 U/mg、40.12 U/mg和15.04 U/mg。

4 小結與討論

研究通過ITS PCR擴增法鑒定了一株野生真菌為JZBHM001，該真菌屬于Lactarius屬，GenBank登錄號為KC703008，系統發育分析表明了該菌在屬內的遺傳地位。通過研究其生理特性發現其具有蛋白酶、磷酸酶和漆酶的活性，可以作為潛在開發的一種資源。

野生的生物資源為生物資源的有效利用及開發打下了基礎，因此對野生大型真菌種質資源的開發利用是當前科研工作的重點。分子生物學的快速發展為野生大型真菌的鑒定提供了便捷而又準確的方法。其中，18 S、5.8 S和28 S的序列在進化中趨于保守，種間變化小，而rDNA的內轉錄間隔區（ITS）同時具有多變區和保守區，ITS1和ITS2作為非編碼區，最終不加入成熟核糖體，所以受到的選擇壓力較小、進化速度快、種間差異大，且變異速度存在著較大的差異，適合種及種以下水平的分類研究[10]。作者曾利用ITS序列對蘑菇屬的野生大型真菌及其分離物進行了分子鑒定，證明了該方法的可靠性[11，12]。

蛋白酶、磷酸酶和漆酶是食用菌中常見的幾種生物酶類，在工業和農業生產中都具有一定的應用前景，同時這些酶類在催化代謝、調節植物生長發育和生物降解方面都能發揮重要的作用。通過檢測發現該野生菌各項生理指標與之前農業部都市農業（北方）重點實驗室在北京周邊采集的野生食用菌黃傘、血紅鉚釘菇、短柄粘蓋牛肝菌和馬勃相比較，蛋白質質量分數和水溶性多糖質量分數相差較大，但是蛋白酶和漆酶活性高于上述4個品種，磷酸酶活性高于黃傘和血紅鉚釘菇[13]。因此從應用的角度分析，JZBHM001具有人工馴化的價值，馴化后針對漆酶活性可以展開發酵工藝的研究，擴大該菌的應用潛力。

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