集約化養雞過程中新城疫免疫存在問題的探討

【摘 要】雞新城疫（雞瘟）是雞的一種烈性傳染病，是由雞新城疫病毒引起的一種急性高度傳染性疾病。免疫預防是重要的防治手段，但影響免疫效果的因素有很多，諸如疫苗的質量、其他疫病的影響、強毒感染和變異株出現、免疫時間和免疫程序不當、雞場環境衛生較差等。尤其是疫苗的保存溫度對疫苗的效價影響最大。為此，我們對雞新城疫疫苗設置不同溫度刺激半小時稀釋后免疫，以期找出解決影響免疫效果因素的方法和為疫苗合適的保存溫度提供佐證材料。

【關鍵詞】雞新城疫；抗體；血凝；血凝抑制

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 雞新城疫（ND）凍干苗

來源于遵義市動物疫病控制中心。

1.1.2 試驗雞群

來源于遵義市紅花崗區深溪、南關兩個鎮蛋雞、肉雞6戶養殖大戶，共計6000羽。

1.1.3 主要試劑

檸檬酸三鈉、重鉻酸鉀、硫酸、0.9% 生理鹽水、PBS液。

1.1.4 主要儀器與設備

96孔V型微量血凝板、單道和八道微量精密移液器、加樣槽、吸嘴、微型振蕩器、離心機、恒溫箱。

1.2 試驗時間與地點

2009年12月，在深溪、南關兩鎮選定了蛋雞、肉雞養殖各3戶進行雞群免疫。實驗室工作于2011年8～12月在紅花崗區農牧局動物疾病控制中心實驗室進行。

1.3 影響疫苗免疫效果因素分析

1.3.1 是疫苗檢查不嚴影響免疫效果

（1）瓶蓋檢查。檢查瓶蓋是否松動、脫落。瓶蓋松動、脫落的疫苗因其密閉保存條件改變會使疫苗的抗原性（免疫原性）降低進而導致疫苗的效價降低、失效甚至產生副作用。

（2）標簽檢查。檢查標簽上的生產批文批號、生產日期、疫苗性狀、保存條件、保存時間、使用劑量。沒有取得生產批文批號的疫苗質量不可靠；生產日期和保存時間的檢查主要看疫苗是否超過保存期，超過保存期的疫苗效抗原性（免疫原性）降低或消失，進而導致疫苗的效價降低、效價差，甚至失效；保存條件是否與標簽上規定的條件一致，不符合標簽規定保存條件保存的疫苗，疫苗的抗原性（免疫原性）降低或消失，進而導致疫苗的效價降低甚至失效。

1.3.2 疫苗保存不當影響免疫效果

（1）保存溫度不當。保存溫度過高要或過低均會使疫苗的抗原性（免疫原性）降低或消失，進而導致疫苗的效價降低甚至失效。

（2）保存避光不當。疫苗保存需要避光保存，如果避光條件不好也會使疫苗的抗原性（免疫原性）降低或消失，進而導致疫苗的效價降低甚至失效。

1.3.3 疫苗使用操作不當影響免疫效果

（1）疫苗稀釋不當。疫苗稀釋不當有幾種情況：不用規定的稀釋液稀釋疫苗；不按規定的稀釋劑量稀釋疫苗；稀釋液與疫苗溫差太大，會使疫苗的抗原性（免疫原性）降低或消失。

（2）疫苗使用不當。疫苗使用不當有幾種情況：不按規定的使用方法使用；不按規定的使用劑量使用；使用器械、注射部位消毒不嚴。

（3）使用過程中保管不當。疫苗在稀釋后使用過程中因保管不當，使稀釋后的疫苗長時間置于強光或高溫環境下會使疫苗的抗原性（免疫原性）降低或消失，進而導致疫苗的效價降低甚至失效。

1.4 試驗方法

1.4.1 試驗分組

將雞新城疫（ND）疫苗從低溫冰箱拿出后，分別在15～60℃（以5℃為梯度）恒溫條件下保存30min后稀釋進行免疫，從低溫冰箱拿出后立即稀釋免疫，并設空白對照組。試驗總共12組。

1.4.2 1%紅細胞懸液制備[5， 6]

由健康雞心臟或翅靜脈采血，放入加有抗凝劑的離心管內（按抗凝劑：全血=1：2的比例），迅速混勻。在離心機中以3000轉/min離心5min，用吸管吸去上清液和紅細胞上層的白細胞薄膜，將沉淀的紅細胞加生理鹽水，慢慢混合均勻，再在離心機中3000轉/min離心5min，棄去上清液，再加生理鹽水混勻，如此反復離心4～5次，最后一次離心后的紅細胞，棄去上清液，即為紅細胞泥。放入4℃冰箱中可保存2～3天。使用時用1ml吸管吸取0.1ml紅細胞泥，然后加入9.9ml的生理鹽水，此即1%紅細胞懸液。現用現配。

1.4.3 血清制備

每只雞翅靜脈采血0.5～1ml，靜置待血清析出后或離心備用。

1.4.4 血凝（HA）試驗[7，8～15]

①先用微量移液器向96孔V型反應板的每孔加生理鹽水25μl；

②用微量移液器吸取待測抗原25μl于第一孔中并抽吸6次混合，后吸出25μl至第2孔，依次倍比稀釋到第11孔，棄去25μl；

③微量移液器再吸取1%紅細胞懸液依次加入各孔，每孔25μl；

④置于微量振蕩器上振蕩1min后室溫（18～22℃）靜置30min觀察結果；

⑤將反應板傾斜成45°，沉于孔底的紅細胞沿著傾斜面向下呈線狀流動者為沉淀，表明紅細胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的紅細胞鋪平孔底，凝成均勻薄層，傾斜后紅細胞不流動，說明紅細胞被病毒凝集。能使雞紅細胞完全凝集的抗原的最高稀釋倍數，稱為該抗原滴度紅細胞凝集效價。即沉淀的前一孔即為該抗原的效價。

⑥4單位抗原校正，按逐級稀釋的方法將抗原作相應稀釋后的HA試驗，當從第五孔開始為完全沉淀，所以表明所配4單位抗原準確。

1.4.5 血凝抑制（HI）試驗

每排孔檢查1份血清。步驟如下：

①微量移液器先加25μl生理鹽水于各孔中；

②用微量移液器吸取待檢血清25μl置于第1孔中，然后倍比稀釋至第11孔，棄去25μl，最后一孔不稀釋，為紅細胞對照；

③用微量移液器吸取配制好的抗原，每孔25μl；

④置于微量振蕩器上振蕩1min，混合均勻；

⑤室溫靜置20min；

⑥用微量移液器吸取1%紅細胞懸液于每孔各加25μl；

⑦置于微量振蕩器上振蕩1min，混合均勻，室溫靜置40min后觀察結果；

⑧結果判定：以完全抑制紅細胞凝集的血清最大稀釋度為該血清的HI滴度，以2的指數表示。

2 結果與分析

2.1 血凝（HA）試驗結果

HA試驗結果，檢測用抗原在微量反應板倍比稀釋第8孔完全凝集1%紅細胞，其抗原效價為1：256。并對4單位抗原作了校正，4單位抗原校正成立。

2.2 血凝抑制（HI）試驗結果與分析

空白對照組：空白對照組免疫抗體效價為log4。常規對照組：常規對照組免疫抗體效價為log64。試驗組：試驗組各溫度段疫苗免疫抗體效價分別是15℃為log64；20℃為log32；25℃為log16；30℃為log8；35℃為log8；40℃為log8；45℃為log4；50℃為log4；55℃為log4；60℃為log4。

由上可知，溫度上升1個梯度（5℃）刺激疫苗30min，疫苗免疫抗體滴度降低1個滴度，當溫度上升到40℃及40℃以上刺激疫苗30min，疫苗失去有效抗原性。當處置溫度≤25℃時疫苗免疫均有效。

2.3 過期疫苗、保質期內瓶塞松動疫苗、性狀顏色與標簽不符疫苗免疫效價檢測分析

過期疫苗免疫抗體效價為log2；保質期內（過一半保存期）瓶塞松動疫苗免疫抗體效價為log2；性狀顏色與標簽不符疫苗免疫效價為log0。

3 結論與討論

3.1 影響疫苗效價的因素

3.1.1 疫苗質量

除正規合法的廠家生產的疫苗質量能保證外，新城疫凍干苗潮濕、瓶蓋松動均能影響疫苗的質量，進而影響疫苗的效價。

3.1.2 保存溫度

疫苗從出廠到代理商，再到養殖戶的過程中可能要經過多次的融凍，雖然標簽在有效期之內，但效價已經明顯降低，甚至失效。我們研究結果顯示，疫苗從低溫保存設備拿出后立即稀釋進行免疫的常規操作，與在25℃溫度刺激疫苗30min后稀釋免疫均能達到有效免疫效果，但高于25℃溫度對疫苗進行刺激后免疫達不到有效免疫的效果。

3.1.3 外界環境

天氣突變、通風不良、舍內氨氣過濃等應激因素都會影響免疫效果。而飼料營養不均衡也影響免疫效果。

3.1.4 其他因素

此外，疫苗正確的稀釋和免疫方式是免疫質量保證的關鍵。而雞體內的母源抗體、疫苗之間相互干擾、消毒藥與抗病毒藥、機體抵抗力、合理免疫程序均影響疫苗效價。

3.2 免疫過程中影響免疫效果的因素

3.2.1 疫苗檢查不嚴影響免疫效果

（1）瓶蓋檢查。檢查瓶蓋是否松動、脫落。瓶蓋松動、脫落的疫苗因其密閉保存條件改變會使疫苗的抗原性（免疫原性）降低進而導致疫苗的效價降低、失效甚至產生副作用。

（2）標簽檢查。檢查標簽上的生產批文批號、生產日期、疫苗性狀、保存條件、保存時間、使用劑量。沒有取得生產批文批號的疫苗質量不可靠；生產日期和保存時間的檢查主要看疫苗是否超過保存期，超過保存期的疫苗效抗原性（免疫原性）降低或消失進而導致疫苗的效價降低價差甚至失效；保存條件是否與標簽上規定的條件一致，不符合標簽規定保存條件保存的疫苗，疫苗的抗原性（免疫原性）降低或消失進而導致疫苗的效價降低甚至失效；疫苗性狀是否與標簽上描述的性狀一致，與標簽上描述的性狀不一致的疫苗已變性（變質），可能導致效價降低、失效甚至產生副作用。

3.2.2 疫苗保存不當影響免疫效果

（1）保存溫度不當。保存溫度過高要或過低均會使疫苗的抗原性（免疫原性）降低或消失，進而導致疫苗的效價降低甚至失效。

（2）保存避光不當。疫苗保存需要避光保存，如果避光條件不好也會使疫苗的抗原性（免疫原性）降低或消失，進而導致疫苗的效價降低甚至失效。

3.2.3 疫苗使用操作不當影響免疫效果

（1）疫苗稀釋不當。疫苗稀釋不當有幾種情況：不用規定的稀釋液稀釋疫苗；不按規定的稀釋劑量稀釋疫苗；稀釋液與疫苗溫差太大，會使疫苗的抗原性（免疫原性）降低或消失。

（2）疫苗使用不當。疫苗使用不當有幾種情況：不按規定的使用方法使用；不按規定的使用劑量使用；使用器械、注射部位消毒不嚴。都會使疫苗的抗原性（免疫原性）在家禽免疫應答過程中不能充分發揮進而影響免疫抗體的形成導致免疫效果受影響。

（3）使用過程中保管不當。疫苗在稀釋后使用過程中因保管不當，使稀釋后的疫苗長時間置于強光或高溫環境下會使疫苗的抗原性（免疫原性）降低或消失，進而導致疫苗的效價降低甚至失效。

3.3 保證疫苗效價的綜合措施

一是從正規廠家進購疫苗，并在使用時仔細檢查瓶蓋是否松動、脫落，按照說明書要求進行稀釋和免疫。

二是正確的疫苗保存、運輸方式，根據疫苗類型選擇相應的保存方式，在運輸過程中根據疫苗類型（需常溫或低溫保存）和運輸距離選擇合理的運輸保溫方式，立即使用的需低溫保存的疫苗在短距離運輸時可選擇冰盒等簡便的保溫設備。盡量減少運輸次數和反復凍融次數。

三是選擇合理的免疫時間。盡量選擇在早晨或傍晚氣溫較低時候進行免疫，溫度過高不僅影響疫苗質量，而且應激反應大。根據雞群年齡及健康狀況適時進行免疫。

四是實驗室時保持合適的溫度。溫度的高低影響到抗原、抗體及紅細胞的活性的高低，溫度過高時會破壞紅細胞表面的凝集素，溫度過低時出現不凝集或不抑制現象而使監測結果不準確，所以在實驗前必須將所有需要用的物品達到室溫下才能進行檢測，最適宜溫度為18～25℃。

五是掌握正確的判定標準。每做一批試驗設1孔為標準陽性血清對照孔作為參照（也可作為抗原含量的間接效價），以紅細胞與病毒的凝集完全被抑制的孔來確定HI抗體滴度。即豎放微量板讓沉積的紅細胞能自然流動的最后孔為HI價。

3.4 解決免疫過程中影響免疫效果因素的方法

3.4.1 針對疫苗檢查不嚴采取的措施

（1）認真檢查瓶蓋。發現瓶蓋松動、脫落的疫苗不能使用。

（2）認真檢查標簽。沒有取得生產批文批號的；生產日期和保存時間超過保存期；保存條件是否與標簽上規定的條件一致的；疫苗性狀是與標簽（或說明書）上描述的性狀不一致的疫苗不能使用。

3.4.2 針對疫苗保存采取的措施

對于疫苗的保存通常要求避光低溫保存。但不同的疫苗有具體的不同要求，對任何一種疫苗都應仔細閱讀其標簽和說明書，嚴格按標簽和說明書上要求的保存條件進行保存疫苗，不能隨意改變疫苗標簽和說明書上要求的保存條件，以確保疫苗有效地進行保存。杜絕因保存不當導致疫苗效價降低甚至失效。

3.4.3 針對疫苗使用操作不當采取的措施

（1）疫苗的稀釋。疫苗的稀釋嚴格按要求，使用規定的稀釋液、按規定的稀釋劑量進行稀釋，在稀釋疫苗時要注意使稀釋液的溫度與待稀釋的疫苗溫度接近。

（2）疫苗使用。疫苗在使用時要認真閱讀疫苗標簽和說明書，嚴格按標簽和說明書上的要求做到按要求的使用劑量、使用方法、使用部位進行免疫，同時使用的器械、注射部位按要求嚴格消毒。

（3）疫苗使用過程中的保管。疫苗稀釋后在使用的過程中要嚴格做到避光、低溫保存，稀釋后的疫苗不能置于強光照射和高溫環境下。