pCDNA 3.1/ EC—SOD真核載體的構建及在巨噬細胞中的表達

摘要：目的 為明確EC-SOD在動脈粥樣硬化發生發展中的作用，課題組體外構建pCDNA 3.1/EC-SOD真核表達載體，并觀察其在THP-1單核源性巨噬細胞中的表達情況。方法 重組質粒經PCR、酶切以及序列分析正確無誤后，借助Lipofectamine 2000將轉染到THP-1單核源性巨噬細胞中，24h后倒置熒光顯微鏡下觀察轉染情況。結果 重組質粒經酶切鑒定、PCR和測序分析后，證實pCDNA 3.1/EC-SOD質粒構建成功。將pCDNA 3.1/EC-SOD通過脂質體轉入THP-1單核源性巨噬細胞后，倒置熒光顯微鏡下觀察轉染效率。結論 pCDNA 3.1/EC-SOD載體構建成功，并成功在THP-1單核源性巨噬細胞中表達，為研究EC-SOD在動脈粥樣硬化發生發展中的作用奠定了基礎。

關鍵詞：EC-SOD；THP-1單核源性巨噬細胞

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一種廣泛存在于生物體內的金屬酶，是體內重要的抗氧化防御系統，包括銅鋅超氧化物歧化酶（CuZnSOD）、錳超氧化物歧化酶（MnSOD）以及最近日益得到重視的細胞外超氧化物歧化酶（ECSOD）[1]。EC-SOD是Marklund等在1982年發現的一種分泌型糖蛋白，主要由巨噬細胞和血管平滑肌細胞產生，它是惟一分布在細胞外發揮抗氧化作用的酶，對機體的氧化/抗氧化平衡起至關重要的作用[2，3]。EC-SOD可以清除脂質過氧化物、減輕氧自由基對組織細胞的過氧化損傷，并能降低脂質過氧化物形成，從而保護血管內皮免受氧自由基的損傷，防止動脈粥樣硬化（Atherosclerosis， AS）的形成[4，5]。為了更深層次的研究EC-SOD的作用機理，我們構建了PcDNA-3.1/EC-SOD真核表達載體，并成功轉染了THP-1單核源性巨噬細胞，為進一步研究EC-SOD的作用奠定了基礎。

1資料與方法

1.1主要實驗儀器和試劑 大腸桿菌DH5α（北京博邁德生物技術有限公司）；PcDNA-3.1（+）質粒由本實驗室保存；DNA 相對分子質量maker、限制性內切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ、T4 DNA 連 接 酶（Fermentas公司）；Taq DNA 聚合酶、dNTP （Takara公司）；Lipofectamine2000（Invitrogen公司）；質粒小量制備試劑盒、DNA純化回收試劑盒（Axygen公司）。HF160W CO2孵箱（上海力申科學儀器技術公司）；CKX31相差顯微鏡 （OLYPUS公司）；721-型分光光度計（惠普上海分析儀器有限公司產品）。RPMI-1640培養基 （GIBCO.BKI公司）；高速低溫離心機 （艾本德公司）；Universal HoodⅡ型凝膠成像系統和酶標儀680 （Bio-Rad公司）；實時熒光定量基因擴增儀FTC-3000 （Funglyn Biotech公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所）；佛波酯（phorbol myristate acetate， PMA）、同型半胱氨酸、MTT、二甲基亞楓DMSO （Sigma公司）； Trizol（Invitrogen公司），逆轉錄試劑盒和熒光PCR試劑盒（Fermentas公司），引物由上海生工公司合成。

1.2方法

1.2.1 THP-1單核源性巨噬細胞的培養 THP-1單核細胞加入含15%胎牛血清的RPMI-1640培養液，于5% CO2、37℃的培養箱中培養，以2×106個/ L接種于培養瓶中，加入濃度為500 μmol/ L的PMA后培養48 h，顯微鏡下觀察細胞貼壁狀態和分化情況，證實THP-1單核細胞是否分化為巨噬細胞。

1.2.2 EC-SOD基因的PCR擴增 收集培養的巨噬細胞，以提取總RNA作為逆轉錄模板，以cDNA為模板擴增EC-SOD基因編碼區域序列，上游引物：5'-CCCAAGCTTATGCTGGCGCTACTG TGTTC-3' （劃線處為Hind Ⅲ酶切位點）；下游引物：5'-CGGAATTCTCAGGCGGC CTTGCACTCG-3' （劃線處為EcoRⅠ酶切位點），產物大小為718bp。反應體系如下：GC Buffer 12.5 L，cDNA 1 L，dNTP 4 L， Taq DNA 聚合酶0.25 L，游引物各0.5 L，6.25 L H2O。PCR反應參數為95℃預變性4 min；94℃變性30 s， 56℃退火30 s， 72℃延伸30s， 擴增35個循環；72℃延伸7 min，4℃保存。

1.2.3 pCDNA 3.1/EC-SOD重組質粒的構建 將PCR產物電泳后回收目的片段。載體質粒pCDNA -3.1和目的片段分別酶切.酶切后回收產物，按照如下連接反應體系進行連接，：T4 DNA 連 接 酶2L，pCDNA 3.1載體質粒2L，目的片段8L，3L Buffer，H2O 5 L。將連接反應產物轉化入DH5α細胞，接種到含氨芐青霉素的LB培養基上37℃培養過夜。

1.2.4重組質粒的篩選鑒定 從轉化克隆中挑取單個均勻菌落行PCR鑒定，將陽性的菌落接種LB培養基中搖菌過夜。提取重組質粒，并行雙酶切鑒定。將陽性的重組細菌，進行DNA測序分析。

1.2.5脂質體轉染THP-1單核源性巨噬細胞 將巨噬細胞，棄去培養液，用PBS清洗細胞，加入1 mL無血清無抗生素的RPMI-1640培養基。按質粒DNA（g）與LipofectamineTM 2000（L）1：2的比例，將DNA于500 L無血清培養基中稀釋；LipofectamineTM 2000使用前輕輕混勻，取適量稀釋在500 L無血清培養基中并與稀釋的質粒DNA混合后將混合物加到培養瓶中，培養5 h后棄去轉染液，換用10%胎牛血清的培養液繼續培養24 h，利用熒光顯微鏡觀察重組載體在細胞中的表達情況，收集細胞作進一步分析。

2結果

2.1重組質粒的酶切鑒定和測序分析 陽性克隆經EcoRⅠ和Hind Ⅲ 雙酶切后得和兩個片段，符合預計結果（見圖2）。測序分析結果與Genebank 上述 ECSOD mRNA序列（NM_003102.2 ）比對分析表明，核苷酸序列的同源性為99.99%，有一處位點的堿基序列發生了變化， 氨基酸序列同源性為100%，屬無義突變，DNA 測序峰值均勻一致（見圖2），說明擴增到的EC-SOD是正確的。

2.2重組質粒pCDNA 3.1/EC-SOD轉染巨噬細胞 將重組質粒pCDNA 3.1/EC-SOD轉染巨噬細胞24 h后，在熒光顯微鏡下觀察到巨噬細胞內表達大量的綠色熒光蛋白（見圖3）。

2.3重組pCDNA 3.1/EC-SOD在巨噬細胞中的表達 將重組質粒pCDNA 3.1/EC-SOD轉染巨噬細胞24 h后，收集細胞后分別采用熒光實時定量PCR和蛋白免疫印跡方法檢驗EC-SOD的表達。如圖4A所示：分別與對照組和空質粒組相比pCDNA 3.1/EC-SOD組中EC-SOD mRNA的表達分別升高1.72倍和1.91倍（P<0.01）；同時，EC-SOD的蛋白表達在重組質粒組中分別升高了1.68倍和1.87倍（P<0.01）。

A：重組pCDNA 3.1/EC-SOD在巨噬細胞中mRNA的表達； B： 重組pCDNA 3.1/EC-SOD在巨噬細胞中蛋白的表達。**P<0.01，與對照組相比；△P<0.05，與空質粒組相比。

3討論

隨著我國經濟社會的不斷發展，心腦血管疾病的發病率逐年升高，已經排在各種疾病之首。其中，動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）及其并發癥在心腦血管疾病中占了相當大一部分，由AS導致的心肌梗死、腦梗死以及冠心病等心腦血管疾病，在目前人類病死原因中居首位。因此，關于AS發病機制的研究一直是國內外學者的研究焦點。基體在正常情況下處于氧化和抗氧化的動態平衡，當在某些因素的刺激下會打破這種平衡，發生氧自由基產生與清除間的失衡，導致活性氧（Reactive oxygen species，ROS）蓄積，引起蛋白發生氧化損傷，進一步導致其結構和功能紊亂，從而發生氧化應激[6]。氧化應激主要通過誘導血管炎癥基因表達的改變、啟動過氧化作用、加速炎癥反應，促進細胞增殖等途徑參與調控了AS的進展[7]。

若細胞內氧自由基的產生大于清除，或外源性氧化物質攝入過量時，機體會加速氧化物質的清除，而防御系統來抵抗氧自由基造成的損傷。其中細胞外超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）可以通過催化超氧陰離子自由基而產生歧化反應，而保護機體細胞免受自由基的攻擊和損害。EC-SOD是唯一分布于細胞外并發揮抗氧化功能的酶，主要由巨噬細胞和血管平滑肌細胞分泌，是血管壁中酶的重要來源[8]。在細胞外，EC-SOD可以與細胞表面硫酸乙酰肝素結合，催化超氧陰離子自由基（O2-·）歧化生成過氧化氫（H2O2），H2O2進一步生成水，從而清除O2-·，以保護組織和細胞免受自由基的損傷，參與阻止AS的形成。

近年來，大量臨床和流行病學資料及循證醫學證據表明[9，10]，高同型半胱氨酸血癥（Hyperhomocysteinemia，HHcy）可通過增加自由基的生成，引起脂質和內皮細胞的氧化損傷；促進血管平滑肌細胞增殖；誘發胰島素抵抗；并進一步誘發AS的發生發展，是繼高血壓、高血脂、糖尿病、吸煙、肥胖等因素后AS的又一獨立危險因素。同型半胱氨酸（Homocysteine， Hcy）是一種含硫氨基酸，在體內主要通過甲硫氨酸循環和轉硫途徑代謝，而發揮生物學效應。本文中成功在體外構建EC-SOD的重組載體并利用liposuction 2000TM轉染入巨噬細胞且成功表達。

在AS進展過程中，EC-SOD作為唯一在細胞外發揮抗氧化作用的酶，其所保護作用及作用機制仍有待進一步的研究。EC-SOD發現之初，其功能和作用并未受到大家足夠的重視和關注。EC-SOD在抵抗氧化物誘導的組織損傷方面發揮著非常重要的作用，因此，深入研究其作用機制將為提高機體抗氧化能力和重建自由基平衡提供新的治療靶點，同時也為預防和治療心腦血管疾病開拓了新的途徑。

參考文獻：

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編輯/申磊