紫外線誘變在青霉素G生產菌種中的應用

摘要：目的 探討紫外線誘變在青霉素G生產菌種中的作用和使用價值。方法 采用細胞脫壁后再進行紫外線誘變處理的方法，選育高產優質菌種。結果 701菌種在發酵相對效價為108.2%、相對產量為106.4%均明顯高于618菌株的100%、100%，結果具有統計學意義（P<0.05）；瓶口紗布層數為6層時，701菌株為108.4%、8層時為109.15、10層時為107.2%，均維持在較高水平，無顯著變化，而618菌株分別為100%、93.1%、80.7%，隨著氧氣減少，發酵效價也隨之減少，結果具有統計學意義（P<0.05）。結論 本研究通過搖瓶篩選得到701菌株，該菌株相比于618菌株發酵效價和總產量有一定程度提高，對氧的需求也相對降低，值得推廣應用。

關鍵詞：紫外線誘變；青霉素G；生產菌種

青霉素G是抗菌素的一種，青霉素G是指通過從青霉菌培養液中提取的一種物質，這種物質的分子中含有青霉烷和能破壞細菌的細胞壁的成分，青霉素G能夠在細菌細胞的繁殖期起到殺菌的作用，是第一種能夠治療人類疾病的抗生素[1]。而在青霉素G在實際發酵生產菌種的制備過程中，常會因為細胞壁的存在而受到影響，細胞壁會降低對刺激性因子的敏感性[2]。為了克服這一難題，本研究通過采用紫外線誘變選育高產優質菌種，更能加快高產特性菌株的篩選過程，是一種有效的誘變篩選方法，現報道如下。

1資料與方法[3]

1.1一般資料

1.1.1菌株 采用產黃青霉菌618。

1.1.2培養基 ①斜面培養基（%）培養基由以下成分組成：甘油0.75、甘油蜜糖0.75、酵母浸處粉0.5、NaCL 1、CaSO4 0.025、瓊脂2.7；pH 6.8。②菌絲培養基（%）由以下成分組成：玉米漿6.1、蔗糖2.0、CaCO3 0.5；pH 5.8。③再生培養基（%）由以下成分組成：NaNO3 0.3、MgSO4·7H20 0.05、FeSO4-·7H20 0.001、KCL 0.05、KH2PO4 0.1、葡萄糖4、酵母膏0.2、瓊脂2.7、pH 6.8。④穩定劑采用0.7M NaCL。

1.1.3酶 采用纖維素酶+cellulase R-10。

1.2方法

1.2.1原生質體的制備包括菌種培養、胞壁酶處理，具體步驟如下：菌體培養受限將618#菌種新鮮斜面加入一定量的無菌水中，將菌株孢子刮下再制成孢子懸液，再經過玻璃珠打散過濾后取1 mL，將這1 mL袍子懸液接種于40 mL的菌絲培養液中。條件要求為：28℃，240 rpm條件下培養36 h，最后得到菌絲體。胞壁酶處理使用4層無菌紗布過濾菌絲培養液以收集菌絲體，將收集后的菌絲體再使用無菌水洗2～3次，接著再使用穩定劑洗兩次，取1 g左右的菌絲體懸浮于5 mL穩定劑中，再加入5 mg纖維素酶和5 mg cellulase R-10，將其置入30℃恒溫水浴振蕩搖床60 rpm，時間為1.5～2 h。

1.2.2紫外線誘變處理原生質體使用紫外線誘變處理原生質體，操作過程中取原生質體懸浮液適量，并進行紫外線（253.7nm）誘變處理，分別照射25″和40″。

1.2.3高產菌株的檢出將經過紫外線誘變處理后的原生質體懸浮液涂于再生培養基平皿中，恒溫培養7 d。帶菌落長出后，挑選結構緊密，形狀規則的單菌落傳斜面培養后，進行發酵搖瓶的篩選。

1.3療效觀察 觀察紫外線誘變對變異情況的影響，比較701菌株與618菌株兩種菌株的發酵相對效價與相對產量的變化，比較701菌株與618菌株兩種菌株限氧條件下發酵效價的變化情況，比較701菌株與618菌株兩種菌株單位菌絲合成能力。

1.4統計學方法 采用SPSS 11.0軟件進行統計學處理，計量資料采用t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2實驗結果

2.1比較紫外線照射時間對原生質體致死作用的影響本研究通過對產黃青霉菌618進行紫外線處理，并分別采用25″和40″的時間計量處理原生質體，結果發現，紫外線照射25″時致死率為75%，紫外線照射40″時致死率為82.8%，結果具有統計學意義（P<0.05）。

2.2比較兩種菌株發酵相對效價與相對產量的變化經搖瓶發酵篩選得到的701菌種，701菌種在發酵相對效價為108.2%、相對產量為106.4%均明顯高于618菌株的100%、結果具有統計學意義（P<0.05）。

2.3比較兩種菌株在限氧條件下發酵效價的穩定性本研究通過采用改變瓶口紗布層數來改變供氧的方法考查兩種菌株在限氧條件下發酵效價的穩定性。瓶口紗布層數為6層時，701菌株為108.4%、8層時為109.15、10層時為107.2%，均維持在較高水平，無顯著變化，而618菌株分別為100%、93.1%、80.7%，隨著氧氣減少，發酵效價也隨之減少，結果具有統計學意義（P<0.05）。

2.4比較兩種菌株單位菌絲合成能力單位菌絲合成能力是考查一個新菌株是否有推廣生產價值的主要參數之一，在本研究中，701菌株單位菌絲合成能力為105.2%明顯高于618菌絲的100%，結果具有統計學意義（P<0.05）。

2.5比較兩種菌株的穩定性將701菌株傳代后其F1代、F2代、F3代發酵效價與總產量均無顯著變化，結果具有統計學意義（P<0.05）。

3討論

本研究結果表明，產黃青霉菌在細胞壁去除之后，對紫外線的敏感度也隨之增強，相對更長時間的紫外線照射，菌株存活個體變異概率也隨之升高，為培育新的菌株提供更多可能性。本研究通過搖瓶篩選得到701菌株，該菌株相比于618菌株發酵效價和總產量有一定程度提高，對氧的需求也相對降低，值得推廣應用。

參考文獻：

[1]熊宗貴.發酵工藝與原理[M].中國科學技術出版社，2008：31.

[2]翁艷軍.青霉素產生菌的原生質體融合[J].中國抗生素雜志，2009，6（3）：129-130.

[3]謝虹，周元元，梁建生.法夫酵母高產蝦青素復合誘變育種的研究[J].食品研究與開發，2010，10（9）：312.

編輯/張燕