利用分子標記輔助選擇對龍特浦B米質和白葉枯病抗性的改良

摘要：以改良天豐B為低直鏈淀粉含量合成基因和白葉枯病抗性基因供體，以龍特浦B為受體，利用分子標記輔助選擇和常規不育系選育方法，對保持系龍特浦 B的直鏈淀粉和白葉枯病抗性進行了改良。 改良后的龍特浦B保留了原有的大部分性狀，并具有直鏈淀粉含量低、抗白葉枯病、株高變矮的新特性。

關鍵詞：不育系；直鏈淀粉；白葉枯病；分子標記輔助選擇；基因聚合；改良

中圖分類號： S336；S511.03 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0069-03

收稿日期：2014-03-10

基金項目：國家水稻產業技術體系建設專項（編號：CARS-01-73）。

作者簡介：韓義勝（1974—），男，湖北宣恩人，碩士，助理研究員，從事水稻種質創新研究。E-mail：hanys135@163.com。

通信作者：徐靖，女，碩士，助理研究員，主要從事植物生物技術研究。E-mail：xujing6732807@126.com。雜交水稻在我國水稻產業中占據重要的地位，其產量優勢已被廣泛認可；但是在產量繼續大幅度提高受到空間制約的情況下，水稻種植的效益問題逐漸引起人們的重視，高產、優質、多抗的復合型水稻品種取代單一產量優勢的品種已成為必然趨勢。在沒有重大技術突破的情況下，現代雜交水稻育種很大程度上就是親本不斷聚合優異性狀的改良型育種。隨著分子生物學的發展，水稻中許多優異基因已被定位，這為利用分子標記輔助選擇（marker-assisted selection，MAS）技術對作物遺傳改良奠定了基礎。近年來，MAS技術在基因轉移或聚合上的應用獲得了很大成功。如Huang等運用MAS技術分別將水稻白葉枯病抗性基因Xa-4、xa-5、xa-13和Xa-21聚合到同一水稻品種中，獲得高抗白葉枯病的品種[1]；陳紅旗等利用MAS技術將3個稻瘟病抗性基因聚合到金23B中，獲得高抗稻瘟病的品種[2]。利用MAS技術將多個抗病基因聚合以培育高抗病害材料的方法，具有經濟高效的特點，但是將優良品質基因和抗性基因聚合到同一品種中的研究卻相對較少。

龍特浦A（簡稱特A）是福建省漳州市農業科學研究所選育的野敗型秈型三系不育系，具有配合力強、適應性廣、易于繁殖種的優點。特優系列雜交稻組合在我國許多省份曾大面積應用，僅1998 年全國推廣面積就達76.71 萬hm2，占雜交水稻總面積的512%[3]，但特A也有直鏈淀粉含量高、不抗白葉枯病等缺點，應用受到很大限制。因此，改良特A很有必要，對不育系的改良實質上就是對保持系的改良。本研究以改良天豐B（簡稱天豐B）為目標基因供體，龍特浦B（簡稱特B）為受體，利用雜交、MAS和常規不育系選育方法，對特B的米質（主要是直鏈淀粉含量）和白葉枯病抗性進行了改良。改良后的特B保留了原有的穗大、粒多特性，同時具有直鏈淀粉含量低、抗白葉枯病、株高變矮的新特性，在風雨天氣頻繁、白葉枯病多發的海南地區，新特B具有廣泛的應用前景。

1材料與方法

1.1試驗材料

受體親本為特B，直鏈淀粉含量為26.5%，不抗白葉枯病。天豐B為低直鏈淀粉合成基因供體，直鏈淀粉含量為15.7%；攜帶廣譜性白葉枯病抗性基因Xa23，抗白葉枯病。供體由廣東省農業科學院水稻研究所提供，試驗各世代材料均種植于海南省農業科學院永發基地，常規水肥和蟲害管理；接種用白葉枯Ⅳ病菌由海南省農業科學院植保所提供。

1.2目標基因連鎖標記

以與控制直鏈淀粉合成的Wx基因連鎖的SSR標記RM190[4]和與Xa23基因連鎖的標記RM206[5]為MAS標記。標記由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成，其他主要生物試劑由上海博彩生物科技有限公司合成。

1.3DNA提取和PCR擴增

DNA提取參照桑賢春等的方法[6]。20μL PCR反應總體系為：2 μL正、反引物（5 μmol/L）；0.3 μL dNTP（10 mmol/L）；0.2 μL Taq酶（5 U/μL）；2 μL 10×PCR buffer[200 mmol KCl；200 mmol/L Tris-HCl，pH值8.3；100 mmol/L （NH4）2SO4；15 mmol/L MgCl2]；2 μL DNA模板；11.5 μL ddH2O。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃復性45 s，72 ℃延伸1 min，35次循環；72 ℃延伸 7 min。反應完成后設15 ℃保護溫度。采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染按照施勇烽等的方法[7]進行。

1.4培育新特B的方法

以特B為母本、天豐B為父本進行雜交，特B為輪回親本。回交時，利用MAS技術并結合農藝性狀表現，選取RM190和RM206標記雜合條帶的單株連續回交3代，至BC3F1時自交，在BC3F2群體中，選取2個標記都為純合條帶的單株，以特A為母本，連續測保、加代。在回交轉育過程中，以保持不育性和理想株型為篩選條件，選擇株型緊湊、劍葉直立、株高較特B稍矮的單株為測保單株。最后通過對BC3F6各單株進行直鏈淀粉含量測定，以直鏈淀粉含量在15%～17%的單株為入選單株（圖1）。

1.5白葉枯病抗性和直鏈淀粉含量的測定

白葉枯病抗性鑒定采用人工剪葉接種法[8]；稻米直鏈淀粉測定參照GB/T 15683—2008《大米直鏈淀粉含量的測定》進行。

2結果與分析

2.1標記分析與選擇

RM190和RM206在供、受體親本間（P1和P2）的多態性良好，能精確區分雜合和純合基因型，適宜MAS育種。2個標記在BC3F2群體均出現3種帶型（圖2）。回交時，每次都選2個標記均為雜合帶型的單株回交，至BC3F1，然后自交。在BC3F2群體中，首先用RM190檢測，將帶型為3的單株挑出，然后用RM206檢測，再次將帶型為3的單株挑出，此時挑出的單株已經聚合低直鏈淀粉合成基因和Xa23基因，且處于純合狀態。從658個BC3F2單株中選擇25個農藝性狀較好的單株用于回交轉育和加代。通過連續6次轉育、加代，并對轉育材料進行米質檢測、白葉枯病抗性鑒定和農藝性狀優選，最終獲得了2個抗白葉枯病，株型與原特B相似但株高略矮、具有不同低直鏈淀粉的特B改良系，分別編號為D1、D2。

2.2白葉枯病抗性鑒定

采用海南白葉枯主要生理小種Ⅳ病菌接種2個特B改良系，進行白葉枯病抗性鑒定，在分蘗結束回水期接種，20 d后調查發現，2個特B改良系病斑長度≤1.2 cm的株數占總株數的90%，全部表現為高抗，與供體天豐B抗性相似，明顯強于原來的特B（表1）。

3結論與討論

3.1稻米品質的改良

稻米品質內涵豐富，但直鏈淀粉一直被認為是稻米品質的核心指標之一，對蒸煮和食味品質指標，如稻米的吸水性、脹性、黏性和軟硬度等有著決定性的影響[9]。低直鏈淀粉是優質稻米的重要指標。稻米淀粉形成機理比較復雜，栽培條件和遺傳組成都對直鏈淀粉有較大影響[10-13]，從遺傳上改良稻米直鏈淀粉仍是育種專家的主要研究方向。多數研究認為，直鏈淀粉由1對或2對主效基因控制，并受微效多基因的修飾。目前公認蠟質基因Wx是控制直鏈淀粉的主效基因[14]，因此尋找與Wx基因連鎖的分子標記是MAS技術育種的關鍵環節。本研究利用RM190標記進行分子標記輔助選擇，對改良特B稻米直鏈淀粉檢測結果顯示，含量均在16%左右，與供體接近。由此可見，在選育直鏈淀粉梯度的育種材料時，可以用標記RM190進行分子輔助選擇。

3.2水稻白葉枯病抗性改良

截至 2013 年，已報道的白葉枯病抗性基因已有38 個[15]，但不同抗性基因的抗病力和抗譜卻有較大差別。在目前已鑒定并定位的抗性基因中，Xa23具有抗性強、抗譜廣、抗性持久、表型顯性等特點[8]。本研究選擇已導入Xa23基因的天豐B作為改良特B白葉枯病抗性的供體。從獲得的2個改良系接種白葉枯Ⅳ病菌表現看，Xa23基因對海南白葉枯病生理小種病菌具有較好的抗性。

3.3利用MAS技術聚合多個基因的改良型育種

對于表型鑒定困難或鑒定費時費力的一些性狀，MAS育種無需考慮環境條件對基因表達的影響，可以在苗期或低世代進行選擇。但是，MAS技術的準確性依賴于目標基因與連鎖標記的緊密程度，連鎖越緊密，選擇結果越可靠。因此開發與目標性狀（基因）緊密連鎖的分子標記是進行MAS技術育種的前提條件。隨著水稻高密度遺傳圖譜的構建和水稻全基因組測序的完成，分子標記的開發越來越便捷高效，利用MAS技術進行有利基因的聚合育種必將成為現代育種的重要途徑，特別是抗性育種[3-4]，但是將抗性基因和優良品質基因通過MAS技術聚合在同一個品種中卻不多見。抗性好、質優、產量高應是篩選水稻良種的必然要求。本試驗將低直鏈淀粉合成基因和白葉枯病抗性基因聚合在特B中，檢測表明2個改良系的直鏈淀粉含量和白葉枯病抗性都達到了預期目標。

參考文獻：

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