RP—HPLC測定茶葉中沒食子酸、兒茶素和表兒茶素的含量

摘要：建立了測定茶葉中沒食子酸、兒茶素和表兒茶素的反相高效液相色譜分析方法（reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC）。樣品經超聲提取后，利用Kromasil C18色譜柱分離，流動相為乙腈 ∶水 ∶磷酸（90 mL ∶10 mL ∶0.1 mL），流速0.8 mL/min，檢測波長278 nm，柱溫30 ℃。沒食子酸進樣量在0.066～1.650 μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系（r=0.999 9），平均回收率為97.1%，RSD為1.1%（n=6）；兒茶素進樣量在0.240～6.000 μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系（r=0.999 6），平均回收率為 97.5%，RSD為1.5%（n=6）；表兒茶素進樣量在0.252～6.300 μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系（r=0.999 7），平均回收率為 96.9%，RSD為12%（n=6）。試驗結果表明，建立的方法操作簡便、數據精確，可用于茶葉中沒食子酸、兒茶素和表兒茶素的含量測定。

關鍵詞：茶葉；沒食子酸；兒茶素；表兒茶素；RP-HPLC

中圖分類號： TS272.7 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0322-02

收稿日期：2013-10-28

作者簡介：鄒盛勤（1970—），男，江西奉新人，碩士，教授，從事天然產物活性成分的提取與分析研究。E-mail：zsqycxy@163.com。

通信作者：姜瓊，男，湖北潛江人，碩士，講師，從事天然產物開發與研究。E-mail：qqj2000@163.com。茶葉為山茶科山茶屬植物茶（Camellia sinensis）的芽葉。茶葉一名始載于《名醫別錄》，“世醫治暑病，以茶葉飲為首藥”[1]。茶葉全草可作藥用，性微溫，具有發汗解暑、行水散濕、溫胃調中、利水消腫的功效[2]。我國擁有豐富的茶葉資源和數千年的茶文化歷史。茶葉中具有多種活性成分，如茶多酚、茶多糖、茶皂素、可可堿、咖啡堿、揮發油、氨基酸等，其中多酚類化合物主要由沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯等30多種化學物質組成[3]，具有調血脂、降血糖、抗腫瘤、抗衰老、美容減肥等藥理作用[3-5]。茶多酚的定量方法主要有高效液相色譜法和毛細管電泳法等[6-9]。茶葉化學成分的研究報道較多，但同時測定茶葉樣品中沒食子酸、兒茶素和表兒茶素含量的方法尚未見報道。本試驗建立反相高效液相色譜法（reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC）同時測定浙產茶葉中沒食子酸、兒茶素和表兒茶素的含量，旨在為茶葉中沒食子酸、兒茶素和表兒茶素的定量分析及其藥效基礎物質的研究提供依據。

1材料與方法

1.1材料與儀器

沒食子酸、表兒茶素和兒茶素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為：110831-200302、110877-200916、110831-200911），乙腈（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司），水為超純水，其余試劑均為分析純。084龍井、龍井、白茶、越劍茶和浙農113茶葉品種均購自浙江省，經鑒定為茶（C. sinensis）的芽葉。

Waters高效液相色譜儀（515泵，2996光電二極管陣列檢測器，Empower中文色譜工作站，美國）；RO-MB-10D高純水機（杭州永潔達膜分離設備廠）；CP225D電子分析天平（德國Sartourius公司）；FW100型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；SK2510HP超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司，功率：250W，頻率：59 kHz）。

1.2溶液配制

1.2.1對照品溶液分別精確稱取1.32、4.80、5.04 mg沒食子酸、兒茶素和表兒茶素對照品，置于20 mL容量瓶中，加適量甲醇溶解后，稀釋至刻度，搖勻后配制成含0.066 mg/mL沒食子酸、0.240 mg/mL兒茶素和0.252 mg/mL表兒茶素的對照品混合溶液。

1.2.2 樣品溶液茶葉樣品于恒溫干燥箱中80 ℃下干燥 6 h，高速粉碎機粉碎。分別精確稱取2 g各茶葉樣品粉末，分別置于50 mL具塞錐形瓶中，分別加入50 mL 95%乙醇后稱重；超聲提取45 min，冷卻后用甲醇補足損失重量，搖勻后用 0.45 μm 濾膜過濾，取過濾液作為樣品溶液。

1.3檢測波長的選擇

對照品溶液采用光電二極管陣列檢測器在190～400 nm波長范圍內進行紫外掃描，選擇合適的檢測波長。

1.4色譜條件

色譜柱為Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈 ∶水 ∶磷酸（90 mL ∶10 mL ∶0.1 mL）；流速 0.8 mL/min；檢測波長278 nm；柱溫為30 ℃。

1.5精密度試驗

分別精確吸取10 μL含沒食子酸、兒茶素和表兒茶素的對照品混合溶液，平行進樣5次，以峰面積計算色譜系統精密度。

1.6重現性試驗

取5份茶葉樣品，每份約2 g，按“1.2.2項”中樣品溶液制備方法制備樣品溶液。精確吸取樣品溶液各10 μL，分別進樣，測定其峰面積積分值，用外標法計算含量。

1.7加樣回收率試驗

精確稱取6份已知沒食子酸、兒茶素、表兒茶素含量的茶葉樣品，每份約1 g，按高、中、低3種濃度分別加入適量對照品制備樣品溶液，進樣測定含量。

1.8線性關系試驗

用微量注射器精確吸取1、7、13、20、25 μL含沒食子酸、兒茶素和表兒茶素的對照品混合貯備液，進樣分析，按色譜條件測定峰面積，以對照品的進樣量為橫坐標（μg），峰面積為縱坐標（μV·s）。

1.9樣品含量測定

精確吸取制備的樣品溶液各10 μL，平行進樣3次，測定沒食子酸、兒茶素和表兒茶素峰面積積分值，外標法計算平均含量。

2結果與分析

2.1檢測波長

試驗測得對照品溶液中沒食子酸最大吸收波長為2163、271.7 nm，兒茶素最大吸收波長為203.4、278.8 nm，表兒茶素最大吸收波長為203.4、278.8 nm（圖1）。因此選擇278.0 nm作為檢測波長，此波長下沒食子酸、兒茶素和表兒茶素均有較強的紫外吸收，信噪比高，基線平穩。

參考文獻：

[1]宋立人，洪恂，丁緒亮，等. 現代中藥學大辭典：下冊[M]. 北京：人民衛生出版社，2001：1489-1492.

[2]張國民，李平忠，孫晶. 茶葉化學成分及研究現狀[J]. 農業與技術，2012，32（5）：226-226，230.

[3]姜守剛，蔣建勤，王建營，等. 茶多酚的提取分離和分析鑒定研究[J]. 藥學進展，2005，29（2）：72-77.

[4]劉作春，李玉山. 恩施綠茶多糖對糖尿病模型大鼠血糖的影響[J]. 現代預防醫學，2009，36（7）：1234-1235.

[5]陳建國，江月仙，來偉旗，等. 茶多糖對四氧嘧啶糖尿病小鼠調節血糖及其抗氧化作用的探討[J]. 毒理學雜志，2009，23（4）：299-301.

[6]孫志棟，顧富強，梁月榮，等. 茶多酚提取優化工藝研究[J]. 天然產物研究與開發，2007（19）：490-493.

[7]康海寧，陳波，韓超，等. HPLC法測定茶葉水提液中五種兒茶素和咖啡堿及其用于茶葉分類的研究[J]. 分析測試學報，2007，26（2）：211-215，220.

[8]朱旗，Clifford M N，毛清黎，等. LC-MS分析普洱茶和茯磚茶與紅茶成分的比較研究[J]. 茶葉科學，2006，26（3）：191-194.

[9]張國民，廖予琦，王慶忠. HPLC內標標準曲線法測定茶葉中4種兒茶素和咖啡因[J]. 昆明學院學報，2010，32（3）：47-50.