HPLC法測(cè)定六味地黃膠囊中馬錢苷含量

摘要：目的 建立六味地黃膠囊中馬錢苷含量測(cè)定方法。方法 采用Phenomenex色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸（8：92）；流速1.0ml·min-1，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為236nm。結(jié)果 馬錢苷在11.25μg/ml～180.0μg/ml范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系（r=0.9993），定量限為7.88ng·ml-1，回收率為97.1%，RSD為1.2%（n=9）。結(jié)論 本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確。方法的穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，可作為六味地黃膠囊質(zhì)量分析控制方法。

關(guān)鍵詞：六味地黃膠囊；馬錢苷；高效液相色譜

六味地黃膠囊由熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓澤瀉六味中藥經(jīng)提取精制而成，為硬膠囊劑，內(nèi)容物為淺棕色至棕色的粉末和顆粒；味苦，微酸。本方源于脈安沖劑，具有滋陰補(bǔ)腎之功，臨床用于腎陰虧損、頭暈耳鳴、骨蒸潮熱、盜汗遺精[1]。酒萸肉為山茱萸科植物山茱萸Cornus of ficinalisSieb.etZucc.的干燥成熟果肉。山茱萸中主要成分有有機(jī)酸及其酯類、五環(huán)三萜及其酯類、環(huán)烯醚萜苷類、鞣質(zhì)類、多糖、維生素、氨基酸和礦物質(zhì)等。《中國(guó)藥典》[1]六味地黃膠囊含量測(cè)定項(xiàng)采用薄層掃描法測(cè)定熊果酸存在于許多藥材，如山楂，馬鞭草，車前草等非山茱萸的特有成分。并與齊墩果酸在天然植物中是共生共存的[2]，他們都屬三萜酸，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上是差向異構(gòu)體，極性幾乎無(wú)差別，在薄層板上應(yīng)用無(wú)法分離開(kāi)，所以測(cè)定的量是熊果酸與齊墩果酸含量的總和。為加強(qiáng)本品內(nèi)在質(zhì)量控制，同時(shí)對(duì)方法中供試品制備的提取溶劑、提取方法、提取時(shí)間、提取溶劑用量均進(jìn)行了考察，制定了本品中的馬錢苷含量測(cè)定方法。

1儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀，G1315D DAD二極管陣列檢測(cè)器，所用軟件為ChemStation色譜工作站。Milli-Q Advantage A10超純水機(jī)，Satorius ME5電子分析天平，電熱恒溫水浴鍋。

1.2試藥 六味地黃膠囊（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格每粒裝0.3g，批號(hào)120701、120702、130101、130102）；馬錢苷對(duì)照品，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院（批號(hào)為120752-201115）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2色譜條件

色譜柱：Phenomenex色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸（8：92）；流速：1.0ml·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：236nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μl，見(jiàn)圖1。

3制備溶液

3.1對(duì)照品 取適量馬錢苷，精密稱定，混入50%甲醇制成每1ml含馬錢苷60μg的溶液，即得。

3.2供試品 取裝量差異項(xiàng)下的本品，混勻，取約0.5g，精密稱定，置錐形瓶中，精密倒入25ml50%甲醇，密塞，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足缺失量，搖勻，濾過(guò)。取濾液10ml，加氧化鋁柱（100～200目，4g，內(nèi)徑為1cm）上，用50ml 40%甲醇洗脫，收集流出液及洗脫液，蒸干，殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中并稀釋到刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

4線性關(guān)系考察

取馬錢苷適量，制得一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液（濃度為180μg/ml），將儲(chǔ)備液分別稀釋成濃度為11.25μg/ml、22.50μg/ml、45.00μg/ml、90.00μg/ml、180.0μg/ml的溶液，進(jìn)樣5μl，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得馬錢苷回歸方程為Y=35.4757X+0.7569，r=0.9998，說(shuō)明馬錢苷在11.25μg/ml～180.0μg/ml，呈良好線性關(guān)系。

按信噪比（S/N）為10：1計(jì)算，定量限為7.78ng/ml。

5精密度試驗(yàn)

吸取馬錢苷溶液各5μl，重復(fù)6次，用峰面積計(jì)算RSD值為0.79%，說(shuō)明該方法精密度良好。

6重復(fù)性試驗(yàn)

取同一供試品（批號(hào)為120701），按3.2制備供試品溶液，平行制備6份，測(cè)定，結(jié)果馬錢苷的平均含量為3.1mg/g，RSD=1.0%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

7中間精密度試驗(yàn)

取同一供試品（批號(hào)為120701），按3.2制備供試品溶液，由兩位分析人員于不同時(shí)間分別制備6份供試品并分別使用兩臺(tái)儀器測(cè)定，計(jì)算RSD值為1.3%，說(shuō)明其方法中間精密度良好。

8穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品（批號(hào)為120701），按3.2步驟，分別在第0、1、2、4、6、8、12、16h進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算峰面積RSD值馬錢苷為0.5%，說(shuō)明供試品溶液在16h內(nèi)穩(wěn)定良好。

9回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號(hào)120701，馬錢苷的含量為3.1mg/g）九份，每份0.5g，分別按80%、100%和120%加入對(duì)照品，按3.2制備供試品溶液，分別精密吸取10？滋L，注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，見(jiàn)表1。

試驗(yàn)結(jié)果表明，馬錢苷平均回收率為96.7%，RSD為0.8%。

10樣品測(cè)定

取4批樣品，按3.2步驟，分別吸取供試品和對(duì)照品溶液各5μl，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算，見(jiàn)表2。

11討論

11.1色譜條件耐用性考察：本文對(duì)不同品牌色譜柱、不同柱溫和不同流動(dòng)相比例進(jìn)行了考察，結(jié)果表明本文采用的色譜條件耐用性良好。

11.2測(cè)定波長(zhǎng)的選擇及色譜峰純度驗(yàn)證：馬錢苷是酒萸肉的主要活性成分之一，其含量能反應(yīng)六味地黃膠囊的質(zhì)量；根據(jù)馬錢苷的全波長(zhǎng)紫外吸收光譜及文獻(xiàn)，選擇236nm做為測(cè)定波長(zhǎng)，經(jīng)試驗(yàn)在此波長(zhǎng)下，供試品色譜中馬錢苷峰與其它雜質(zhì)峰達(dá)到很好的分離，陰性樣品無(wú)干擾。使用二極管陣列檢測(cè)器，對(duì)對(duì)照品溶液與供試品溶液色譜中馬錢苷的吸收峰，分別讀取了190～370nm的紫外吸收光譜。經(jīng)對(duì)二者的紫外吸收光譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)馬錢苷紫外吸收光譜相似度達(dá)到97%。

11.3提取方法的考察：采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化提取方法，考察提取溶劑、提取時(shí)間、提取方法及溶劑用量，4個(gè)因素對(duì)提取結(jié)果的影響。最終確定提取方案為：25ml的50%甲醇，加熱回流1h[3]。

11.4六味地黃膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用薄層色譜法測(cè)定熊果酸含量，重現(xiàn)性、準(zhǔn)確性較差，本實(shí)驗(yàn)建立的方法操作簡(jiǎn)單、快速，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可作為六味地黃膠囊質(zhì)量控制的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]張艷敏，趙儀學(xué)，景連葉.HPLC法測(cè)定六味地黃膠囊中丹皮酚的含量[J].河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，1（24）：52～53.

[2]袁厚蘭，王琳.HPLC法測(cè)定不同來(lái)源山茱萸中馬錢苷的含量[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2013，9（4）：23～25.

[3]林燕飛，孫靜蕓，胡巧平.山茱萸中馬錢苷含量測(cè)定的樣品處理方法改進(jìn)[J].中國(guó)藥業(yè)，2005（10）.

編輯/許言