深低溫冷凍法與酶洗法制備兔組織工程同種異體氣管支架研究

摘要：目的探討深低溫冷凍與酶洗法制備的兔組織工程同種異體氣管支架在去除抗原性、維持生物力學及保護細胞外基質方面的效果差別。方法18只成年新西蘭兔隨機分為氣管未處理作為對照A組，實驗B組通過深低溫冷凍法處理，實驗C組通過酶洗法處理，各組樣本數均為6。將各組標本處理后，光鏡觀察行HE染色后標本，戊二醛固定后電鏡掃描，測量并記錄氣管最大拉伸力、破裂力和變異率等生物力學性能。結果光鏡觀察顯示A組有大量完整的氣管粘膜上皮細胞；實驗B組可見部分氣管粘膜上皮細胞；實驗C組標本未見上皮細胞，且細胞核碎裂。對照A與實驗B組在電鏡顯示，氣管支架可見豐富的細胞基質，未暴露膠原纖維；實驗C組見較少細胞外基質，膠原纖維暴露。組間兩兩比較，氣管支架的最大拉伸力、最大破裂力和變異率均無統計學差異。結論綜合組織學、掃面電鏡和生物力學分析，應用深低溫冷凍法制備的氣管支架可較好的保留細胞外基質，但不能有效的去除抗原；通過酶洗法制備氣管支架可以有效地去除抗原，但未能保留較完整的細胞外基質。

關鍵詞：深低溫冷凍法；酶洗法；組織工程氣管支架；細胞外基質

Cryoapplication Methods and Detergent-Enzymatic of the Rabbit tissue Engineering Allogeneic Tracheal Stent

LI Jian-zhong1， WU Fan2，WANG Jian2， ZHANG Zhi-pei2，YAN Xiao-long2，LIANG Bing1，GAO Feng1，MA Zhao-hui1，LI Xiao-fei2

(1.Department of Cardiothoracic Surgery，The 211st Hospital of PLA，Shenyan 150080，Liaoning，China;2.Department of Thoracic Surgery，Tangdu Hospital of The Fourth Military Medical University，Xi'an 710038，Shaanxi，China)

Abstract：ObjectiveThis study mainly focused on finding out the optimal method to obtaine rabbit histological engineering tracheal matrix between cryoapplication and detergent-enzymatic. Methods18 adult rabbits were divided into 3 groups (each n =6)， and group A were not treated as control group，groupB was treated with the method of cryopreservation，group C was treated with detergent-enzymatic method. HE dyes and scanning electron microscopy were used to observe the morphology and ultrastructure of the treated tracheal matrices. The biomechanical properties including maximum tensile force， rupture force and aberration rate of the treated tracheal matrices were measured. ResultsThere were a lot of epithelial cells in the tracheas of group A and some epithelial cells in the tracheas of group B.But the tracheas of group C could not be seen complete epithelial cells. Under scanning electron microscopy，there were abundant extracellular matrix and collagen fiber in group A， B and C. Finally， no statistical differences were found in the maximum tensile force， rupture force and aberration rate of all groups. ConclusionThe method of cryopreservation could retain abundant extracellular matrix and collagen fiber for tracheal stent. Howevr，this way can not remove the antigen. The method of enzymatic， by which the antigen can be removed， and extracellular matrix，but it can not retain a lot of extracellular matrix.

Key words：Deep freezing method; Enzyme method; Tissue engineering tracheal stent; Extracellular matrix管移植被視為長段氣管缺損（成人>6 cm，兒童>30%）切除后實施修復重建的最有效途徑，同種異體組織工程氣管是氣管外科重建研究的熱點。制備同種異體組織工程氣管支架是制約同種異體組織工程氣管發展的關鍵技術之一，深低溫冷凍法[1-2]和酶洗法[3-4]是目前制備同種異體組織工程氣管支架的主要方法。

1資料與方法

1.1一般資料 成年新西蘭白兔購于第四軍醫大學實驗動物中心，脫氧膽酸鈉購于北京奧博星生物技術有限責任公司，脫氧核糖核酸酶-Ⅰ（DNase-Ⅰ）購于德國Roche公司，兩性霉素B購自美國Amresco公司，青霉素購自哈藥集團制藥總廠。蔡司正置顯微鏡Axioskop 40 購于德國ZEISS公司，鎢燈絲掃描電鏡VEGA3 LMH購于捷克Tescan公司，電子實驗機購于日本Shimadzu公司。

1．2方法

1.2.1實驗動物分組 成年新西蘭兔24只，體重2.5～3.0 Kg，雌雄不限，由第四軍醫大學實驗動物中心提供。隨機等分為三組，每組6只。A組是對照組，行新鮮氣管檢測； B、C是實驗組，分別進行深低溫冷凍法和酶洗法處理。

1.2.2獲取氣管 將新西蘭兔行耳緣靜脈空氣栓塞致死，在無菌條件下取出氣管，迅速剝離氣管上的疏松結締組織。經生理鹽水沖洗，并在200000 U/L青霉素、200 mg/L慶大霉素溶液中浸泡3 min。

1.2.3標本制備 深低溫冷凍法[2-3]制備B組氣管支架：將取出的氣管經生理鹽水沖洗，并在200000 U/L青霉素、200 mg/L慶大霉素溶液中浸泡3 min后，放入無菌生物袋中，后浸泡于冷凍保護液中，置于4℃冰箱冷平衡20 min，置于程序降溫儀的冷凍箱中程序降溫，降溫速率-1℃/min，溫度降至-80℃后投入-196℃液氮冷凍6~8 w。檢測前置于37℃恒溫水浴箱內，輕輕搖動。酶洗法制備實驗C組氣管支架：將標本先置入4℃純凈水中浸泡48 h，在含有4%去氧膽酸鈉生理鹽水中浸泡3 h，后在含有DNase-I2000KU/L的生理鹽水中浸泡3 h，如此循環3個周期，然后浸泡在4℃的PBS 溶液中準備檢測。

1.2.4生物力學檢測 用直尺測量對照A組、實驗B組和實驗C組氣管的長度；參照Macchiarini等生物力學檢測標準，將標本固定在電子實驗機上，測出標本的最大拉伸力、破裂力、破裂點，并算出變異率。

1.2.5組織學顯微鏡觀察粘膜上皮細胞 將獲取的標本浸泡于福爾馬林中24 h，進行脫水、浸納、蠟塊包埋、切片處理后，HE染色，光鏡觀察。

1.2.6掃面電鏡觀察細胞外基質完整性 戊二醛固定獲取標本，梯度脫水，然后用CO2超臨界萃取，噴鉑金5 min，掃面電鏡觀察

1.2.7統計學分析 采用SPSS 16．0軟件進行統計分析，定量數據以均數±標準差(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），以P<0．05為差異有統計學意義。

2結果

2.1生物力學檢測 各組氣管長度均數不相等，差異無統計學意義(P>0.05)。組間兩兩比較顯示，最大拉伸力、破裂力、變異率無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2組織學顯微鏡觀察粘膜上皮細胞 對照A組標本可見氣管粘膜上皮組織有大量完整的粘膜上皮細胞，分布于氣管軟骨，見圖1a；實驗B組標本可見仍有部分完整粘膜上皮細胞，見圖1b；氣管粘膜上皮組織未見完整的粘膜上皮細胞，只有殘存的細胞基質，見圖1c。

圖1

2.3電鏡觀察粘膜上皮細胞 對照A組、實驗C組標本可見豐富細胞外基質，未見膠原纖維，見圖2a、2b； 實驗C組氣管粘膜上皮組織見膠原纖維，未見細胞外基質，見圖2c。

圖2

3討論

同種異體氣管支架是制約組織工程同種異體氣管發展的關鍵因素[3]。免疫原性是同種異體氣管支架作為組織工程氣管的最大阻礙，影響其再細胞化和在血管化，細胞外基質沒有免疫原性，可以促進組織工程氣管的再細胞化和在血管化[4]。深低溫冷凍法和酶洗法是制備同種異體氣管支架的主要方法。深低溫冷凍法制備同種異體氣管支架移植后不能有效的再細胞化和再血管化，最終導致移植失敗。Macchiarini等運用酶洗法制備氣管支架完成了世界首例同種異體組織工程氣管移植，為氣管重建指明了方向[5]。但是，該患者接受移植后8個月，發生了移植段氣管塌陷[6]。這可能是酶洗法制備的氣管支架不利于成軟骨細胞的再細胞化。前期試驗已證實酶洗法處理3個周期是制備兔同種異體氣管支架的適宜周期[7]。

本研究應用深低溫冷凍法和酶洗法制備兔同種異體氣管支架，旨在比較二者在保持生物力學、去除免疫原性及保持細胞外基質方面的效果。生物力學顯示深低溫冷凍法和酶洗法處理的同種異體氣管支架，未見明顯差別。組織學檢查示深低溫冷凍法處理的同種異體氣管支架仍有部分氣管粘膜上皮細胞，酶洗法獲得的氣管支架未見完整的上皮粘膜細胞，并且細胞核破碎。由此可見，酶洗法較深低溫冷凍法更有效的去除免疫原性。電鏡檢查示深低溫冷凍法獲得氣管支架可見豐富細胞外基質，未見膠原纖維； 酶洗法獲取得氣管支架，氣管粘膜上皮組織見膠原纖維，未見細胞外基質。由此可見，深低溫冷凍法獲取的同種異體氣管支架可以保留較多的細胞外基質。因此，經過深低溫冷凍法和酶洗法獲得的氣管支架均不適合于組織工程同種異體氣管的制備。

綜上所述，將深低溫冷凍法和酶洗法相結合，可能制備既可以去除氣管免疫原性，又可以保留較多的細胞外基質，其實際效果有待于動物實驗的進一步研究。

參考文獻：

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[3]Go T，Jungebluth P，Baiguero S，et a1.Both epithelial cells and mesenchymal stem cell-derivedchondrocytes contribute to the survival of tissue-engineered airwaytransplants in pigs[J] .Thorac Cardiovasc Surg， 2010，139(2):437-43.

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[6]S Baiguera， MA Birchall， P Macchiarini. Tissue-engineered tracheal transplantation[J] . Transplantation， 2010. 80(9): 485-491.

[7]李建忠，張志培，汪健，等.酶洗法制備兔組織工程氣管支架的周期研究[J].組織工程與重建外科雜志，2012，8(1):6-7，31.

編輯/肖慧