PCR-RLFP方法檢測IL-6基因啟動子區-634C/G多態性實驗條件研究

摘要：目的探討PCR-RFLP技術判斷IL-6基因啟動子區-634C/G多態性的最適實驗條件。方法對影響PCR的部分因素和影響RFLP方法的一些因素進行研究。結果PCR擴增IL-6基因啟動子區的最適條件為：引物濃度為30umol/L；Taq酶量為5U； dNTP濃度為56μmol／L。最經濟有效的酶切體系為20μl體系中加4μl產物用5U的酶消化9h。結論最佳的實驗條件的探索是進行大批量實驗研究的關鍵。

關鍵詞：白細胞介素-6基因；多態性；聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性；試驗條件糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者一種常見的嚴重的致盲眼病。DR也是DM常見且難治的并發癥之一，在歐美各國四大致盲眼病中占第一或第二位， 在我國也是主要致盲病之一，約10%DM患者在起病后5～9年便可發生DR，15 年后約50 %的人發生DR，25 年后80 %～90 %的人發生DR[1]。DR的發病機制是環境和遺傳因素共同作用的。長期的高血糖是最重要的原因，然而，DR的發生發展不同的個體差異很大，這也說明遺傳可能起一定作用。近年來提出T2DM是一種亞臨床炎癥性疾病，作為炎癥反應的核心細胞因子IL-6，張潔等[2]研究發現隨著糖尿病視網膜病變程度的加重，淚液IL-6含量逐漸升高，提示淚液IL- 6水平與糖尿病視網膜病變的發生有關。體外培養視網膜Muller細胞顯示：糖化蛋白終末產物可引起視網膜Muller細胞產生IL-6，并且存在劑量依賴關系，IL-6的增加與DR的發生密切相關[3]。我們就此多態性進行檢測，旨在探討L-6基因啟動子區-634C/G多態性與中國廣東地區漢族人DR是否存在關聯。限制性內切酶是分子生物學中研究基因變異的一把手術刀，可以特異性切割所識別的堿基序列，利用這個特點，可以用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）方法檢測基因片段中某一位點是否存在變異。L-6基因啟動子區634位點對應限制性內切酶BsrBI（MbiI）的酶切位點，酶切后有三種情況：①酶切后PCR產物長度無變化，為CC基因型；②雜合型，電泳圖譜出現三條帶，即為CG基因型；③PCR產物被切開，為純合型，即為GG基因型。盡管PCR和酶切是兩種比較成熟的技術，但對于不同的模板和引物而言，所需的PCR反應條件是不同的。但如果實驗條件把握不準確，可造成假陰性或假陽性結果，因此有必要對實驗條件加以研究，以得出最適條件，進而才能得出準確可靠的結果。本文為確定PCR-RFLP方法檢測L-6基因啟動子區-634C/G多態性的最適實驗條件，進而研究其與2型糖尿病視網膜病變的關系，對影響PCR反應以及內切酶酶切反應的實驗因素進行了系統的優化研究。

1資料與方法

1．1實驗材料主要儀器：BIO-RAD S1000基因擴增儀；Power Pac 3000型電泳儀和Gel Doc1000紫外圖像分析系統和配套的分析軟件（美國BIO-RAD公司）；5417R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；恒溫和可控水浴箱（上海醫療器械廠）。

主要試劑：合成引物（北京市理化分析測試中心合成）：上游引物：5’-GAGACGCCTTGA AGTAACTG-3’，下游引物5’-AACCAAAGATGTTCTGAAC

TGA-3’。 5U/μl的TaqDNA聚合酶、100mmo1/L的dNTP和限制性內切酶BanII均購于寶生物（大連）有限公司；DNA分子量標記（Marker）購于天根生化科技（北京）有限公司；實驗用水為去離子水。

1．2方法模板DNA的抽提：選用QIAamp DNA Mini kit試劑盒按說明書提取模板DNA，加入100 mL TE緩沖液，65℃水浴15~20min至DNA沉淀物質完全溶解，儲存于4℃冰箱備用。

PCR擴增：首先建立PCR（聚合酶鏈反應）擴增目的DNA的實驗條件?；痉磻w系中模板1μL，10×緩沖液5μL，加去離子水至501μL條件不變，分別變化Taq酶量和dNTP、引物的濃度，按94℃預變性5min，后94℃45s，60℃45s，72℃1min進行30個循環， 最后72℃延伸5min。擴增產物的檢測均用瓊脂糖凝膠電泳法檢測：制備2%的瓊脂糖凝膠（含0.5μg/mL溴乙錠），將擴增產物10μL與溴酚藍加樣緩沖液2μL混勻后和一份5μL MarKer同時加樣，在100V電壓條件下電泳30min，電泳結束后在Gel Doc1000紫外檢測系統中觀察擴增產物的電泳結果。

BsrBI限制性內切酶的酶解:IL-6基因啟動子區-634位點變異純合子GG可以被此內切酶完全切開呈兩條片段(分別為120bp和60bp)，野生純合子CC不被內切酶切開呈一條片段(180bp)，而雜合子CG則部分被內切酶切開呈三條片段(180bp、120bp和60bp)。首先采用過度酶量消化的方法(20μl反應體系中內切酶為10U，擴增產物量為5μL，過夜酶切)找出一能被完全切開的野生純合子GG的DNA。然后使反應體系中10×緩沖液2μL (含BSA)加去離子水至總體積20μL不變，按一定梯度設定酶切所用擴增產物量、內切酶的濃度、酶切時間。酶切后產物的檢測也采用瓊脂糖凝膠電泳法，制備2％瓊脂糖凝膠(含0．5μg／mL的溴乙錠)，將酶解產物10μL與溴酚藍加樣緩沖液2μL混勻后和一份5μLMarker同時加樣，在80V電壓下電泳45min，電泳結束后在Gel Doc 1000紫外檢測系統中觀察酶切產物的電泳結果。

2結果

2.1 PCR實驗條件其它擴增條件不變的情況下設定系列Taq酶量2.5~15U之間，如圖1所示。結果表明，均可以擴增出目的DNA，2.5uTaq酶量產物量較少，其他產物量之間并無顯著性差異。為了使以后擴增更加有效，并且節省酶量，選擇Taq酶量為5.0U。

圖l Taq酶量對PCR的影響

注：M為D2000的DNA分子量標記，依次為100 250 500 750 1000 2000bp

1～6分別為2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 以及15u的Taq酶量。

其它擴增條件不變的情況下設定系列引物濃度，范圍設計在：10～100pmol/ul的濃度之間，如圖2所示。結果表明，均有產物擴出，但隨著引物濃度增加，引物二聚體也逐漸增加，產物量并不增加，選擇引物二聚體較少而產物量高的引物濃度30pmol/ul為最佳濃度。

圖2引物濃度對PCR的影響

注：M為D2000的DNA分子量標記，依次為100 250 500 750 1000 2000bp；1～6分別為10、20、30、40、50以及100umol/L的引物濃度。

其它擴增條件不變的情況下設定系列dNTP濃度，范圍設計在28~168μmol／L，如圖3所示。結果表明：產物量隨dNTP濃度的增加而有所增加，但在56μmol／L后產物量并無變化，選擇其最適dNTP濃度為56μmol／L。

圖3 dNTP濃度對PCR擴增的影響

注：M為D2000的DNA分子量標記，依次為100 250 500 750 10002000bp；1～6：28、56、84、112、140和168μmol/L的dNTP濃度。

2.2 BsrBI內切酶實驗條件酶切反應體積:雖然一般試劑盒的標準酶切體系為50μl，但結合眾多文獻報道和實驗，50μl的反應體積所需的擴增產物量以及內切酶的量均過大，不適宜進行大量的酶切，而且RFLP只需要酶切后電泳檢測得出酶切圖譜，無后續實驗需要，因此設定反應體積為20μl，在此基礎上確定酶量和擴增產物量。

確定酶切所用的擴增產物量:選擇一個能被完全切開而擴增產物量多的模板，用擴增產物2～8μl進行酶切，酶足夠量(10U)、酶切時間延長至過夜，如圖5所示。結果表明：2、4、6、8μl時均可被切開，6、8μl的PCR產物酶切后有極少量的未被切干凈的痕跡，但不影響判斷基因型。2μl電泳結果分辨不清晰，而4μl時結果清晰可辨。為保證能夠酶切完全并且防止過多的擴增產物對內切酶的抑制，選擇4μl為最佳酶切產物量。

圖4擴增產物量對酶切的影響

注：M為100bp遞增的DNA分子量標記；1～4：2、4、6、8μl的擴增產物。

確定酶切的酶量:加入已經確定的擴增產物量，將內切酶的量設計為2.5U～10U四個梯度，酶切時間足夠(過夜)，如圖6所示。結果表明：2.5U、5U、7 U、和10U時沒有明顯差異，均呈現清晰的120bp一條片段（因為60bp片段看不到），說明2.5U的酶量足以完全切開4μl的擴增產物，2.5U內切酶為最合適的酶量。

圖5內切酶量對酶切的影響

注：M為100bp遞增的DNA分子量標記；1—4：2.5U、5U、7.5U、10U的BsrBI內切酶量。

確定酶切時間:酶切反應體系相同，即各加入確定的擴增產物量、內切酶量，酶切時間設置為1～24h，如圖7所示。結果表明：1、3、5、7、9h酶切在原180bp處均有少量痕跡，而9h以后痕跡不明顯，不影響分辨，而且隨酶切時間延長并未發現非特異性切割，所以選擇過夜切割(超過9小時)為最佳酶切時間。

圖6酶切時間的確定

注：M為100bp遞增的DNA分子量標記：1～6分別為酶切1、3、5、7、9和24h

3討論

PCR-RFLP方法是檢測DNA片段是否存在已知位點變異的常用方法，但由于內切酶和切割片段長度的不同，所要求的實驗條件各異，由于實驗條件涉及的因素較多，任何一個環節出現問題均會影響實驗結果，甚至導致實驗失敗，所以探索出一套最合適的實驗條件是以后大批量實驗的保證。

由于PCR后的產物要進行限制性內切酶消化，所以要求PCR的產物量要足夠酶切后的檢測，而且特異性要高，無非特異性擴增，影響分辨的引物二聚體較少，所以此種實驗方法的首要一環是擴增出足以能夠進行限制性內切酶消化而能準確檢測到的目的DNA片段。PCR擴增所涉及的實驗條件很多，包括引物濃度、dNTP濃度、Taq酶的用量、鎂離子濃度、熱循環的次數以及溫度、模板的量等。結合眾多文獻以及前期實驗基礎，本文只對擴增時對產物的特異性及產量影響較大的Taq酶量、引物濃度、以及dNTP濃度等主要實驗影響因素進行了優化研究。

Taq酶量：不同來源和不同批次的Taq酶因其活性有不同程度的變化，可導致擴增效率發生明顯改變。因此，同一研究中最好使用同一批次的Taq酶。通過實驗得出每個反應管所需Taq酶的酶量，在能檢查到足夠擴增產物的情況下盡量用低濃度的酶，以降低檢測成本。

引物濃度：引物濃度不足，PCR效率極低，而過高的引物濃度又會引起模板與引物的錯配，PCR反應特異性下降，同時形成引物二聚體的幾率增大[4]，產生大量的引物二聚體。

dNTP的濃度：標準PCR反應體系中包含4種等摩爾濃度的dNTP，任何一種濃度明顯不同于其他幾種時，會誘發聚合酶的錯誤摻入，降低新鏈合成速度[5]。濃度過低，會降低反應產量，高濃度的dNTP對擴增反應起抑制作用，也許是因為dNTP與Mg2+螯合而引起的反應。

內切酶量以及酶切所用擴增產物量：這兩種條件是密不可分的，進行酶切的過程中，酶的用量過多會造成浪費，而且內切酶貯存液中內含有甘油，當內切酶量過多使甘油濃度超過5％時可抑制內切酶活性，而內切酶量過少會導致切不開或切不完全。同理，酶切時的擴增產物量過多也會造成酶量的相對不足，甚至會對內切酶產生抑制作用，此外，DNA溶解于TE緩沖液，當擴增產物量超過整個酶切體積的1／4時會對內切酶產生抑制作用，而過少會導致電泳后檢測時的片段不清。擴增產物量雖然可以通過分光光度計法以及溴化乙錠熒光定量法測得濃度，但實際應用時仍需要經實驗確定酶切時的擴增產物量。

酶切時間：雖然試劑盒上有參考的酶切時間，但隨著其它實驗條件的變化，也須重新確定，因為酶切時間過長使酶活性喪失，并不會因為時間的延長而減少內切酶的用量，甚至會造成內切酶星號活性(在非標準反應條件下切割與內切酶識別順序相似的序列)的發生[6]，時間過短又會使內切酶的作用未發揮完全。電泳時間必須適度而且一致，時間過長會造成條帶模糊不清，甚至DNA從凝膠中泳出，過短會造成片段分不開，每次電泳時間不一致會造成橫向無法比較。

這些實驗條件之間互相關聯、互相影響，如導致擴增產物切不完全的原因可能是內切酶的用量不足，也可能是酶切時間過短，還可能是酶切體系中擴增產物量過多而對內切酶產生了抑制作用。所以，必須在大批實驗前確定實驗條件。當然，限制性內切酶的緩沖液構成和酶切溫度也是影響內切酶消化的重要因素，但現在的內切酶試劑盒均提供了適宜的緩沖液和酶切所需溫度，所以在此無需討論。

通過上述研究，確定了PCR擴增L-6基因啟動子區進而進行內切酶消化的各種最適實驗條件，為后續研究奠定了基礎，保證了實驗結果的準確可靠。

PCR擴增L-6基因啟動子區的最適條件：最佳引物濃度為30umol /L；最佳Taq酶量為5 U；最適dNTP濃度為56μmol／L；BsrBI酶切的最適條件：20μl的酶切體系中，最佳酶切產物為4μl，最佳內切酶量為5U，酶切時間9h。以上參數偏離最適條件將會影響實驗結果。

參考文獻：

[1]張承芬.眼底病學[M].北京:人民衛生出版社，1997:223-286.

[2]張潔，王偉超，劉素波，等.不同分期糖尿病視網膜病變淚液IL-6的表達[J].中國現代醫學雜志，2012，22（14）：51-54.

[3]Nakamura N，Hasegawa G，Obayashi H，et al.Increased concentration of pentosidine，an advanced glycation end product，and interleukin-6 in the vitreous of patients with proliferative diabetic retinopathy[J].J.DiabetesRes Clin Pract，2003，61(2):93-101.

[4]張維銘.現代分子生物學實驗手冊[M].北京：科學出版社，2003:251.

[5]（美）薩姆布魯克J.拉塞爾D.W，分子克隆實驗指南[M].3版.北京：科學出版社，2002:599.

[6]孫晗笑，陸大祥，劉飛鵬．轉基因技術理論與應用[M].鄭州：河南醫科大學出版社，2000：178-179.編輯/王敏