阪崎腸桿菌檢測方法的研究進展與優化

阪崎腸桿菌（Enterobacter Sakazakii ）是乳制品中近幾年新發現的一種致病菌，是腸桿菌科的一種。目前國際社會上針對該菌的研究無論是在醫學還是公共衛生學上都具有極其重要的意義。阪崎腸桿菌菌型繁多，傳統的血清學鑒定、選擇性和非選擇性增菌等檢測方法存在靈敏度低、耗時長等缺點，難以滿足食品及臨床應用。國內外學者對阪崎腸桿菌檢測技術進行了大量研究，并取得了一定的進展。檢測方法主要分為以免疫學為基礎的方法、分子生物學方法、聯合方法三類方法。該文就這三類方法研究進展進行概述。

阪崎腸桿茵的生物學性狀及其對人群的健康危害受到人們的關注并被報告。例如，味全配方奶粉2008年年10月份被檢出含有致病菌阪崎腸桿菌。阪崎腸桿菌是奶粉（乳）制品中新發現的一種致病菌。由其引發的嬰兒、早產兒腦膜炎、敗血癥及壞死性結腸炎散發和暴發的病例已在全球相繼出現。多份研究報告表明嬰兒配方奶粉是當前發現致嬰兒、早產兒腦膜炎、敗血癥和壞死性結腸炎的主要感染渠道，在某些情況下，由阪崎腸桿菌引發疾病而導致的死亡率可達40%～80%。阪崎腸桿菌已引起世界多國相關部門的重視。 傳統的檢測方法存在很多缺點，很難滿足現代臨床快速診斷和治療，食品檢測的需求。要了解更準確，快速，簡便，可靠的方法和技術，科學為此已作了大量的研究，試驗方法和識別技術正在不斷發展和完善，并在實踐中不斷取得新的進展，從傳統到更敏感的檢測方法，比較簡單，在發展方向更短的時間 。

1 以免疫學為基礎的檢測方法

免疫學相關技術主要內容是抗原和抗體之間的特異性結合的反應，然后通過免疫放大技術來分辨細菌。由于抗原抗體反應速度快，人們通過這種高靈敏度建立了一系列的檢測方法。已經實踐了的方法有很多種，大致分為熒光抗體（免疫熒光法），同位素標記抗體（放射免疫試驗），酶標抗體（ELISA）為基礎方法。

2 分子生物學方法

分子生物學診斷技術是現代分子生物學與分子遺傳學取得巨大進步的結晶，是在人們對基因的結構以及基因的表達和調控等生命本質問題的認識日益加深的基礎上產生的。近年來，分子診斷技術研究取得了很大進展，尤其是核酸探針技術、PCR技術和基因芯片技術的發展又將分子生物學診斷技術提高到一個嶄新的階段。

聚合酶鏈反應（PCR）技術。近些年，聚合酶鏈反應（PCR）技術快速的發展和應用，主要原理是設計特異性引物，從而擴增阪崎腸桿菌中穩定性強的核酸序列，通過試驗數據來分析阪崎腸桿菌的存在，因此PCR技術主要在于靶序列的挑選和引物的相關設計。

我國用PCR技術檢測食物中是否存在阪崎腸桿菌，以牛肉，奶粉，煮熟的雞肉為試驗對象，在實驗對象中人工添加阪崎腸桿菌，PCR技術和傳統的檢測結果一樣，檢出限為100CFU/25g，準確性達100%。由此說明PCR技術具有特異性強、敏感性高、操作簡便、快速高效等優點，各國學者均致力于PCR方法檢測阪崎腸桿菌技術的研究，改進的PCR檢測方法發展起來，常見的有熒光定量PCR，多重PCR，隨機擴增多態性DNA檢測，免疫捕捉PCR，IMS-PCR等。

噬菌體裂解試驗。噬菌體對細菌有很高的裂解作用，阪崎腸桿菌的高裂解率有利于阪崎腸桿菌的檢測，何曉青等發現一種腸桿菌科分屬診斷噬菌體，用其鑒定阪崎腸桿菌只要6分鐘，加上培養菌落時間都只需2天，該方法可用于阪崎腸桿菌的快速檢測，其檢測時間短，效率高，方便易行。

環介導等溫擴增方法。環介導等溫擴增方法（LAMP）是一種新興的核酸擴增方法，2000年日本人Tsugunori Notomi等發現出來的一種新的核酸擴增方法。其原理是通過對靶序列上的6個特定區域設定特定的4條引物，這可以證明出 環介導等溫擴增技術的特異性高，該文原載于中國社會科學院文獻信息中心主辦的《環球市場信息導報》雜志http：//www.ems86.com總第565期2014年第33期-----轉載須注名來源而擴增過程只需在60–65℃反應60min，擴增效率也是很高，在擴增過程中可生成焦磷酸鎂的一種白色沉淀，因此我們可以根據沉淀的渾濁程度來進行判斷，LAMP擴增技術與常規的PCR擴增技術相比，不需要繁瑣的電泳和紫外觀察的過程，也不需要相關PCR儀器，只需要在一段不大于300bp的目的片段上設計6–8（含促環引物）條相關的特異性引物，觀察沉淀的濁度，加之用LAMP技術檢測阪崎腸桿菌只需2h，即使加上增菌的時間也只有15h，大大的提高的效率，便于基層的廣泛使用，具有很高的實用價值。

核酸探針。目前，從鼠傷寒阪崎腸桿菌菌株染色體DNA克隆成功的應用檢測阪崎腸桿菌屬的阪崎腸桿菌探針，應用于食物中阪崎腸桿菌的檢測。20世紀80年代中期發展起來的以放射性同位素核糖體核酸（rRNA）探針，但需要要使用有放射性同位素，只能在特殊的實驗條件下進行，不能廣泛推廣應用。Fitts等人運用DNA-RNA 雜交技術進行食物中阪崎腸桿菌檢測，探針中有同位素特殊的標記，敏感度很高，可以很快的檢測出阪崎腸桿菌，通過對阪崎腸桿菌核糖體RNA（rRNA）及核糖體發育過程中儲存的核酸成分進行相關的檢測。這種天然富含rRNA標靶序列既可以避免了檢測放射性同位素特殊實驗室的要求，也比傳統放射同位素檢測更穩定和更高的敏感性。

基因芯片技術。基因芯片也稱為生物芯片，生物芯片是一種固定著許多知序列DNA探針的硅片或玻片。將通過標記的熒光分子與生物芯片上的固定的探針雜交，通過觀察熒光信號的強弱來判斷出分子的數量以及序列信息，來推斷出是否有目的菌，這種方法可以同時檢測出多個菌種，而且靈敏度高，特異性強。對于檢測阪崎腸桿菌等相關的致病菌有著很大的應用前景。Chizhikov V等采用寡核苷酸芯片進行相關毒力研究，發現了細菌毒力因子可應用于腸道致病菌的分析檢測。

3.聯合方法

最新的研究表明，單一的檢測方法不能夠滿足人們對阪崎腸桿菌快速檢測的所有要求，近年的研究方向主要集中于多種方法的聯合運用上。

IMS-PCR。將樣品用IMS方法處理后用PCR方法檢測可以縮短培養的時間，既滿足高特異性，也具有高度敏感性。Wang等將IMS技術與PCR技術聯合運用，靈敏度達到103CFU/g[3]。

IMS-ELISA。先IMS技術處理后的樣品進行ELISA技術檢測也可以提高檢測的效率，縮短檢測的時間。Taha等將雞翅樣品在蛋白胨水中培養4 h，運用IMS-ELISA聯合方法，整個反應可以在8 h內完成，檢測靈敏度達1.6×103CFU/mL。

噬菌體-生物傳感器。噬菌體-聯合生物傳感器方法能夠克服環境因素的干擾。提高了檢測的效率，縮短了檢測的時間。將鼠傷寒阪崎腸桿菌噬菌體連接無線磁彈性傳感器上，在潮濕濕潤的環境中，可以準確地檢測出阪崎腸桿菌的含量 。

噬菌體-分子生物學。 用噬菌體將某種特異性基因鑲嵌到靶細胞的DNA中，通過基因的表達性從而知道靶細胞的相關信息。Kuhn等把1ux基因通過噬菌體鑲嵌到阪崎腸桿菌DNA中，可在16 h內檢測出樣品中的阪崎腸桿菌。

4.展望

綜上所述，阪崎腸桿菌的檢測技術取得了較大的進展。檢測方法越來越多，同時也日趨向快速、高靈敏度、高特異性、程序簡單化方向發展，這也是食品質量和臨床檢驗的要求。單一技術的檢測方法存在不足之處，通過各種技術間相互結合和補充不僅使各自優點得到最大發揮，也彌補了單獨一種檢測技術的不足，這將是阪崎腸桿菌檢測方法的重要一個研究方向。

（作者單位：長沙醫學院）