頭孢拉定膠囊微生物限度檢查法的驗證分析

【摘要】目的對頭孢拉定膠囊微生物限度檢查法的驗證分析。方法采用幾類菌種對頭孢拉定膠囊做微生物限度檢查法的比較以及驗證實驗，并對驗證實驗結(jié)果進行回顧性分析。結(jié)果用薄膜過濾法進行頭孢拉定膠囊的細菌計數(shù)，所污染的三株驗證用細菌回收率均在70%以上；采用平皿法進行頭孢拉定膠囊真菌計數(shù)，兩株驗證用真菌的回收率也均在70%以上。結(jié)論頭孢拉定膠囊微生物限度檢查法的驗證中，分別采取薄膜過濾法測定細菌計數(shù)結(jié)果，平皿法測定真菌計數(shù)，表明以上方法的可行性與有效性。

【關(guān)鍵詞】頭孢拉定膠囊；微生物限度檢查；驗證

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2014.05.693文章編號：1004-7484（2014）-05-2943-02微生物限度檢查法主要是指檢查非規(guī)定滅菌制劑、原料、輔料受微生物污染程度的一種方法，該檢查法的檢查項目包括對霉菌數(shù)、細菌數(shù)、酵母菌數(shù)和控制菌等指標的檢查[1]。本文就以頭孢拉定膠囊作為研究對象，分析微生物限度檢查法的應用，并作如下報道。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種應用中國藥品生物制品檢定所提供的菌種，包括有白色念珠菌[CMCC（F）9801]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、黑曲霉[CMCC（F）98003]五類菌種。

1.1.2培養(yǎng)基及試劑試驗所用培養(yǎng)基包括有改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、MUG培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基等。試劑選擇為分析純氯化鈉試劑。

1.1.3藥品樣品藥品樣品選擇頭孢拉定膠囊，規(guī)格：0.25g，批號：1201132。

1.1.4試驗儀器本次試驗主要的儀器設備包括有Htysteritest601智能集菌儀、TG16-WS臺式高速離心機、PL1501-S電子分析天平、LRH-250-II生化培養(yǎng)箱，SPX-150生化培養(yǎng)箱，GZX-9140MBE電熱恒溫鼓風干燥箱。

1.2方法

1.2.1制備供試液10g供試品+100ml分析純氯化鈉試劑，在45-50℃水浴中充分浸泡、溶化，制成配比為1：10的供試液。

1.2.2制備菌液將各種菌種，制成每1ml含菌數(shù)50-80cfu的菌懸液。

1.2.3驗證方法選擇頭孢拉定膠囊對細菌生長有較強的抑制作用，且藥典所規(guī)定的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌以及枯草芽孢菌對本藥品均比較敏感，因此本研究決定采用薄膜過濾法進行頭孢拉定的細菌數(shù)測定。但本品對真菌沒有明顯的抑制作用，所以對黑曲霉、白色念珠菌等采用平皿法進行計數(shù)。

1.2.4細菌計數(shù)方法的驗證采用薄膜過濾法，將取10ml1：10供試液置入離心機中離心5min后，取其上清液置入另一離心管中，加入PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至10ml。①試驗組：將濾膜以少量稀釋劑浸濕，再取經(jīng)上述離心方法制備的供試液1ml，加于100mlPH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液過濾，并以500mlPH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，分沖洗三次之后，將制備的大腸埃希菌菌懸液1ml加入沖洗液內(nèi)過濾。再后，將沖洗后的濾膜菌取出，菌面朝上放置，貼在含2mlβ內(nèi)酰胺酶營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，于35℃左右的溫度連續(xù)培養(yǎng)48h計數(shù)。同樣方法，再對枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌進行驗證操作。②菌液組。取大腸埃菌、枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌三種菌稀釋而成的菌懸液各1ml，應用平皿菌落計數(shù)法，測定試驗菌數(shù)。③供試品對照組。取供試液加入量測定供試品本底菌數(shù)，作為供試品對照組[2-3]。[回收率計算方法為：回收率=（試驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù)）÷菌液組平均菌落數(shù)×100%]。

1.2.5酵母菌及霉菌計數(shù)方法的驗證采用平皿法對酵母菌和霉菌進行計數(shù)方法驗證。①試驗組：分別于4個平皿當中，加入1：10的供試液各1ml，再在2個平皿中加入黑曲霉菌、2個平皿中加入白色念珠菌。之后，立刻將玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基傾注其中，在25-28℃溫度下連續(xù)培養(yǎng)72h。②菌液組。將上述兩種菌稀釋而成的菌懸液各取1ml，分別注入平皿中，每個菌平行制備兩個平皿，并立即將玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基傾注其中，以測定所加的試驗菌數(shù)。③供試品對照組：取供試液加入量測定供試品本底菌數(shù)，以其作為供試品對照組（注：上述1.2.4、1.2.5題中的方法均獨立平行試驗3次）。

2結(jié)果

本次研究中，采用薄膜過濾法，沖洗量為500ml進行頭孢拉定膠囊的細菌計數(shù)，通過試驗觀察發(fā)現(xiàn)，3次獨立平行試驗中，所污染的大腸埃菌、枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌三株驗證用菌的回收率均在70%以上，表明本法測定細菌計數(shù)結(jié)果的有效性。而采用平皿法進行頭孢拉定膠囊真菌計數(shù)，在3次平行試驗中，黑曲霉菌及白色念珠菌兩株驗證用菌的回收率也均在70%以上，表示該法對真菌計數(shù)的可行性。微生物限度檢查法的詳細試驗，見表1。

其一，本品對細菌生長可起到抑制作用，因此對本品驗證最好采用薄膜過濾法；其二，在試驗中，由于本品輔料容易引起濾膜阻塞，因此需先進行離心操作，去除輔料，再取上清液沖洗稀釋后，才能保證本品通過濾膜的順利性；其三，制備含β-內(nèi)酰胺酶營養(yǎng)瓊脂平板時，必須嚴格控制好溫度，以保證實驗的有效性；其四，由于本品采取一般薄膜過濾法仍很難除去頭孢拉定的抑菌活性成分，因此在試驗中均采取添加β-內(nèi)酰胺酶加入膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中的方法，以保證三株驗證菌的回收率。但本品對真菌并無抑制作用，因此可采用平皿法來測定真菌。

參考文獻

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[3]謝委，馬永貴，張光勛，謝斌，王文清，施春陽.阿托伐他汀鈣片微生物限度檢查方法學驗證[J].中國藥師，2013，3（3）：1143-1144.