葛根總黃酮的提取精制及含量測定方法研究

陳志民，黃 陽，郭瑩瑩，楊昌云

(中國人民解放軍第180醫院藥學科，福建 泉州 362000)

葛根為豆科植物野葛 Pueraria lobata Ohwi或粉葛 Pueraria thomsonii Benth.的干燥根，具有解肌退熱、升陽止瀉、透疹生津的功效。現代藥理學研究證明，葛根具有改善心腦血管循環、擴張冠脈、改善心臟功能等作用[1－2]。同時，葛根還有提高學習記憶力、抗氧化、抗癌等作用。葛根中主要含有總黃酮這一活性成分，包括葛根素、大豆苷、大豆苷元等異黃酮類化合物。目前，葛根已被制成愈風寧心片、葛根素注射劑等多種制劑上市，這些制劑皆以葛根總黃酮為藥效成分。本試驗旨在探討不同濃度乙醇對總黃酮提取條件的影響，并用溶劑法對其純化。研究表明乙醇回流提取黃酮得率較高[3－5]，本試驗對其進行優選研究，現報道如下。

1 儀器與試藥

UV－8543型可見紫外分光光度計（美國惠普公司）；1100型高效液相色譜儀（Agilent公司），DAD紫外檢測器，Zorbax S8－C18柱（250mm ×4.6mm，5 μm）。葛根素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為0752－9806）；甲醇和乙腈為色譜醇；乙醇為市售分析純；葛根藥材（廣州致信中藥飲片有限公司，粵Y20090085）。

2 方法與結果

2.1 葛根總黃酮含量測定

2.1.1 色譜條件

流動相：甲醇－水－乙腈（12∶80 ∶8）；檢測波長：250 nm；流速：0.8 mL/min；柱溫：25 ℃。

2.1.2 溶液制備

精密稱取葛根素對照品2mg，用甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，避光、室溫下保存，即得對照品溶液。按照2010年版《中國藥典（一部）》[6]葛根供試品溶液的制備方法，取一定量葛根藥材粉末（過3號篩），分別依法制備供試品溶液。

2.1.3 方法學考察

標準曲線繪制：稱取葛根素對照品約2mg，精密稱定，用甲醇溶解并定容于 100 mL 容量瓶中，精密稱取 0，1.5，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，置 10 mL 容量瓶中，甲醇定容。以甲醇為空白，在250 nm波長處測定吸光度。結果見表1。以吸光度 A值對濃度(C，μg/mL)進行線性回歸，得回歸方程 A ＝0.076 8 C ＋0.001 6，R2＝ 0.999 8(n ＝ 6)。

表1 不同質量濃度葛根素在250 nm波長處的吸光度

精密度試驗：取葛根素對照品溶液連續進樣6次，分別測定峰面積。結果的 RSD為0.84%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：依法制備10 μg/mL對照品溶液6份，進樣測定。峰面積結果的 RSD為1.1%（n＝6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，分別于 0，2，4，6，8 h 時進樣分析，根據葛根素的峰面積計算。結果的 RSD為1.0%（n＝5），表明供試品溶液在8 h內穩定。

加樣回收試驗：精密量取8 μg/mL供試品溶液9份，各500 μL，置5 mL容量瓶中，分別加質量濃度為10 μg/mL的對照品溶液300，500，1 000 μL，每個質量濃度平行 3份，加流動相稀釋至刻度，搖勻，取10 μL進樣測定，計算回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n＝9）

2.2 不同批次葛根藥材的含量測定

取4個批次的葛根藥材粉末（過3號篩），依法分別制備供試品溶液，照2010年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥD中高效液相色譜法，精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL進樣測定。色譜圖見圖1，測定結果見表3。表明各批次藥材葛根素含量均高于《中國藥典》規定，符合要求，故選取接近平均含量的第4批藥材作為下一步試驗用藥。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 葛根總黃酮提取工藝研究

根據文獻資料葛根黃酮提取方法[7]，確定葛根提取方法如下。分別取葛根藥材100 g，分別加入10倍量95%乙醇和70%乙醇1 000 mL，加熱回流3 h，濾過，殘渣加入8倍量乙醇，繼續回流3 h，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇，得到浸膏，真空干燥箱干燥，得葛根提取物。分別精密稱取醇提物0.1 g置100 mL容量瓶中，加入95%乙醇溶解并定容，精密量取1.0 mL置100 mL容量瓶中，加入95%乙醇定容至刻度，搖勻，照分光光度法[2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅤB]，在250 nm波長處測定吸光度，根據回歸方程計算含量，結果見表4。結果表明，采取95%乙醇回流提取 2次，每次3 h，乙醇用量第 1次 10倍量，第2次 8倍量，提取效果較好。

表3 不同批次葛根藥材葛根素含量測定結果

表4 不同濃度乙醇提取葛根結果

2.4 葛根總黃酮純化工藝研究

2.4.1 葛根總黃酮純化方法考察

回流法：精密稱取醇提物粉末0.5 g，置錐形瓶中，加入球形微晶纖維素2.0 g分散粉末，加入乙酸乙酯20 mL，稱定質重。水浴回流1 h，放冷，補足乙酸乙酯減失量。抽濾，濾液蒸干。測定蒸發皿前后質量，得固形物質量。用95%乙醇溶解固形物，并定容于50 mL容量瓶中，精密量取1.0 mL置25 mL容量瓶中，定容，再精密量取1.0 mL置10 mL容量瓶中，定容后搖勻，照分光光度法[2010年版《中國藥典（一部)》附錄Ⅴ B]，在 250 nm波長處測定吸光度，根據回歸方程計算含量，結果見表5。

表5 兩種純化方法的比較

萃取法：精密稱取醇提物粉末0.5 g，置25 mL容量瓶中，加入乙醇20 mL。微熱，溶解，轉移至125 mL分液漏斗中，加入乙酸乙酯20 mL，萃取，分取乙酸乙酯層，萃取3次，合并乙酸乙酯層，水浴蒸干。測定蒸發皿前后質量，得固形物質量。用95%乙醇溶解固形物，并定容于50 mL容量瓶中，精密量取1.0 g置25 mL容量瓶中，定容，再精密稱取1.0 mL置10 mL容量瓶中，定容后搖勻，照分光光度法[2010年版《中國藥典（一部)附錄ⅤB]，在250 nm波長處測定吸光度，根據回歸方程計算含量，結果見表5。可見，溶劑萃取法純化葛根總黃酮效果較好。

2.4.2 萃取純化法優化

試驗證明，醇提物溶于不同濃度的乙醇對萃取效率有較大影響。故本試驗設計了3種濃度的乙醇溶解葛根醇提物后再萃取，試驗方法同萃取法，結果見表6。可見，用30%乙醇溶解樣品后再用乙酸乙酯萃取總黃酮可達到較好的純化效果。

表6 不同濃度乙醇對總黃酮純化的影響

3 討論

通過高效液相色譜法，以葛根素為指標，評價不同批次葛根藥材的質量，具有準確、可靠、快速的優點，保證了試驗用藥材的質量。

確定了葛根藥材的提取工藝，95%乙醇回流提取2次，每次3 h，乙醇用量第1次10倍量，第2次8倍量。該工藝對于總黃酮粗提物的純度及轉移率較高。

對于總黃酮的純化，大多采用聚酰胺、大孔樹脂法，這些方法均能得到純度較高的總黃酮，但生產周期長，工藝復雜，成本較高[8]。本研究采用一定量乙酸乙酯萃取法純化總黃酮，成本較低，周期短，乙酸乙酯可重復利用，具有工業化前景。

參考文獻：

[1] 張 琪.中藥葛根資源的有效成分提取及改造研究進展[J].中國中醫藥現代遠程教育，2010，10(5)：206－207.

[2] 楊冬梅，楊世友.高效液相色譜法測定復方黃酮中葛根素含量[J].中國藥業，2010，19(5)：19－20.

[3] 于燕莉.復方葛根片的質量標準研究[J].解放軍藥學學報，2009，25(6)：524－526.

[4] 金 福.葛根不同提取工藝的實驗研究[J].中國中藥雜志，2009，9(5)：1 171－1 172.

[5] 徐 立.葛根不同部位中葛根素含量研究[J].大理學院學報，2009，8(10)：3－6.

[6] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：1 189.

[7] 公衍玲，黃 山，于慧榮.葛根提取方法的比較研究及其工藝條件優化[J].青島科技大學學報，2009，30（5）：416－417.

[8] 涂 華，陳碧瓊，張燕軍.天然總黃酮物質的提取工藝研究進展[J].中國試驗方劑學雜志，2011，17（6）：277－278.