高效液相色譜法測(cè)定紫杉醇亞微乳含量

夏學(xué)軍，王艷寶，徐佳茗，張鵬霄，金篤嘉，劉玉玲

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所·藥物傳輸技術(shù)及新型制劑北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050）

紫杉醇亞微乳是我所研制的不含Cremophor EL、載藥量高、可耐熱壓滅菌、長(zhǎng)期貯存穩(wěn)定的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的水包油型亞微乳輸液[1]。動(dòng)物試驗(yàn)表明，與市售紫杉醇注射液相比，亞微乳可顯著降低過(guò)敏反應(yīng)和毒性。在耐受劑量下，紫杉醇亞微乳比市售注射液對(duì)人乳腺癌MDA－MB－231裸鼠異種移植性腫瘤治療效果更好。目前，該藥已完成臨床前研究，正準(zhǔn)備申報(bào)臨床。為了控制該藥的質(zhì)量，筆者參考2010年版《中國(guó)藥典（二部）》紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)[2]，建立了紫杉醇亞微乳含量測(cè)定的高效液相色譜（HPLC）法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀，包括G1322A型真空脫氣機(jī)、G1310A型四元泵、G1329A型自動(dòng)進(jìn)樣器、G1314B VWD型檢測(cè)器和 Chemstation型色譜工作站（Agilent公司）。紫杉醇對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為100382－200301）；三杉尖寧堿（紫杉醇雜質(zhì)Ⅰ，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為100926－200701）；7－表－10－去乙酰基紫杉醇（紫杉醇雜質(zhì)Ⅱ，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為100925－200701）；紫杉醇亞微乳（批號(hào)為 20110409－1，20110409－2，20110415，規(guī)格為 1.176 g/L）；空白亞微乳（輔料，按紫杉醇亞微乳的處方和工藝不加主藥制備而得，批號(hào)為 20100716）；無(wú)水乙醇（色譜純，J.T.Baker公司）；乙腈（色譜純，J＆K Chemical Ltd.）；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher Scientific 公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Zorbax XDB C18柱（250mm ×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇－水－乙腈（23 ∶41 ∶36）；流速：1.5 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：227 nm。分別取紫杉醇、三杉尖寧堿、7－表－10－去乙酰基紫杉醇對(duì)照品適量，用無(wú)水乙醇溶解制成一定濃度的溶液，分別取10 μL注入高效液相色譜儀，進(jìn)行色譜峰定位。另取紫杉醇、三杉尖寧堿、7－表－10－去乙酰基紫杉醇對(duì)照品適量，用無(wú)水乙醇溶解制成質(zhì)量濃度分別為 0.5，2.5，2.5 μg/mL 的混合溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液，取 10 μL 注入高效液相色譜儀測(cè)定。結(jié)果三杉尖寧堿及7－表－10－去乙酰基紫杉醇與紫杉醇的相對(duì)保留時(shí)間分別為 0.89，1.09 min，分離度分別為 2.40，1.67，色譜圖見(jiàn)圖 1。

2.2 溶液制備

取紫杉醇適量，精密稱(chēng)定，加無(wú)水乙醇溶解制成質(zhì)量濃度為1.2 g/L 的貯備溶液。分別精密量取 0.8，1.0，1.2 mL（相當(dāng)于供試品溶液測(cè)定濃度的80%，100%，120%）各3份，置25 mL容量瓶中，分別加入空白亞微乳（輔料）0.8，1.0，1.2 mL，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成相當(dāng)于紫杉醇含量80%，100%，120%的溶液，即得空白對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：取空白亞微乳（輔料）1 mL，置25 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為輔料溶液，取10 μL注入高效液相色譜儀。結(jié)果表明，輔料對(duì)亞微乳的含量測(cè)定無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖 1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：取紫杉醇適量，精密稱(chēng)定，加無(wú)水乙醇溶解制成質(zhì)量濃度為 1.2 g/L 的溶液。分別精密量取 0.2，0.5，1，1.5，2 mL，置25 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度分別為 9.6，24，48，72，96 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取 10 μL 注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣3次。以質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、平均峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝13.788 7 X－3.424 4， r＝0.999 9（n＝5）。結(jié)果的 RSD 分別為0.12% ，0.12% ，0.10% ，0.16% ，0.08% ，表明紫杉醇樣品質(zhì)量濃度在9.6～96 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

定量限檢測(cè)：紫杉醇質(zhì)量濃度為 0.3 μg/mL，進(jìn)樣量為 10 μL，其峰信號(hào)約為噪音的10倍，計(jì)算得該方法的定量限為3 ng。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一紫杉醇亞微乳樣品6份，按擬訂方法測(cè)定紫杉醇含量。結(jié)果，樣品含量測(cè)定的 RSD為0.31%（n＝6），表明方法重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液 10 μL，分別于 0，2，4，6，8，10，12 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD為0.16%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。取紫杉醇適量，精密稱(chēng)定，加無(wú)水乙醇溶解制成質(zhì)量濃度為 1.2 g/L 的貯備溶液。分別精密量取 0.8，1.0，1.2 mL(相當(dāng)于供試品溶液測(cè)定濃度的80%，100%，120%)各3份，置25 mL 容量瓶中，分別加入空白亞微乳(輔料)0.8，1.0，1.2 mL，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成相當(dāng)于紫杉醇含量80%，100%，120%的溶液，即得空白對(duì)照溶液。按擬訂方法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率測(cè)定結(jié)果（n＝9）

2.4 樣品含量測(cè)定

精密量取本品1 mL，置25 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液；另取紫杉醇對(duì)照品約22mg，精密稱(chēng)定，置10 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，振搖使溶解，精密量取1 mL，置50 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。按擬訂色譜條件，分別取10 μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果，批號(hào)為20110409－1，20110409－2，20110415的樣品中，紫杉醇的含量分別為標(biāo)示量的 95.2% ，96.1% ，97.8% 。

3 討論

2010年版《中國(guó)藥典（二部）》收載了紫杉醇藥品標(biāo)準(zhǔn)，其含量測(cè)定項(xiàng)下的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中，規(guī)定了紫杉醇峰與三杉尖寧堿（雜質(zhì)Ⅰ）峰及7－表－10－去乙酰基紫杉醇（雜質(zhì)Ⅱ）的分離度均應(yīng)大于1.0。在流動(dòng)相篩選時(shí)，在現(xiàn)有色譜條件下，對(duì)目前紫杉醇含量測(cè)定通常采用的3種流動(dòng)相系統(tǒng)（甲醇－水、乙腈－水、甲醇－乙腈－水）進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇－水、乙腈－水系統(tǒng)為流動(dòng)相時(shí)，調(diào)整流動(dòng)相比例使紫杉醇的保留時(shí)間在12 min范圍內(nèi)，方法的系統(tǒng)適用性均不能滿(mǎn)足中國(guó)藥典要求。

在紫杉醇亞微乳研究中，我們采用建立的HPLC有關(guān)物質(zhì)檢查法進(jìn)行紫杉醇亞微乳及空白亞微乳（輔料）的強(qiáng)制降解試驗(yàn)、影響因素試驗(yàn)、加速試驗(yàn)及長(zhǎng)期試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，輔料對(duì)紫杉醇測(cè)定無(wú)干擾，亞微乳降解后主要產(chǎn)生2個(gè)雜質(zhì)，經(jīng)與美國(guó)藥典收載的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)中各個(gè)雜質(zhì)峰的相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行比較，并與雜質(zhì)對(duì)照品的保留時(shí)間進(jìn)行比對(duì)，鑒定降解產(chǎn)物為10－去乙酰基紫杉醇及7－表－紫杉醇。故在擬訂色譜條件下，試驗(yàn)了10－去乙酰基紫杉醇及7－表－紫杉醇對(duì)紫杉醇含量測(cè)定的干擾，結(jié)果10－去乙酰基紫杉醇及7－表－紫杉醇與紫杉醇的相對(duì)保留時(shí)間分別為 0.64，1.71 min，降解產(chǎn)物不干擾主成分測(cè)定。因此，按照 2010年版《中國(guó)藥典（二部）》紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)含量測(cè)定項(xiàng)下規(guī)定的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，即可保證本品測(cè)定方法的專(zhuān)屬性符合要求。

亞微乳是由油、水、表面活性劑組成。由于藥物與油脂分離困難，目前亞微乳含量測(cè)定供試品溶液制備時(shí)，除少量文獻(xiàn)采用以高溫、堿、鹽等破乳后再用有機(jī)溶劑提取藥物的方法外，大多采用直接用有機(jī)溶劑溶解稀釋的方法。由于紫杉醇對(duì)高溫、堿不穩(wěn)定，我們前期曾參考文獻(xiàn)[3]，對(duì)鹽破乳后再用有機(jī)溶劑提取的方法進(jìn)行了研究，但未能同時(shí)獲得紫杉醇與油脂的完全分離及合格的回收率。因此，本方法采用有機(jī)溶劑溶解稀釋的方式制備供試品溶液。對(duì)有機(jī)溶劑進(jìn)行的篩選表明，在測(cè)定濃度下，甲醇、乙腈均不能溶解紫杉醇亞微乳，無(wú)法滿(mǎn)足紫杉醇測(cè)定濃度的要求，故選擇無(wú)水乙醇作為本品的測(cè)定溶劑。

參考文獻(xiàn)：

[1] Xia XJ，Guo RF，Liu YL，et al.Formulation，characterization and hypersensitivity evaluation of anintravenous emulsion loaded with a paclitaxel－cholesterol complex[J].Chem Pharm Bull（Tokyo），2011，59（3）:321－326.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（二部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：1 007－1 008.

[3] 李 萌，王杏林，葛志強(qiáng)，等.HPLC法測(cè)定依托泊苷亞微乳中的藥物含量[J].中國(guó)新藥雜志，2007，16（17）：1 390－1 392.