高效液相色譜法測定紫杉醇亞微乳含量

夏學軍，王艷寶，徐佳茗，張鵬霄，金篤嘉，劉玉玲

（中國醫(yī)學科學院北京協和醫(yī)學院藥物研究所·藥物傳輸技術及新型制劑北京市重點實驗室，北京 100050）

紫杉醇亞微乳是我所研制的不含Cremophor EL、載藥量高、可耐熱壓滅菌、長期貯存穩(wěn)定的具有自主知識產權的水包油型亞微乳輸液[1]。動物試驗表明，與市售紫杉醇注射液相比，亞微乳可顯著降低過敏反應和毒性。在耐受劑量下，紫杉醇亞微乳比市售注射液對人乳腺癌MDA－MB－231裸鼠異種移植性腫瘤治療效果更好。目前，該藥已完成臨床前研究，正準備申報臨床。為了控制該藥的質量，筆者參考2010年版《中國藥典（二部）》紫杉醇標準[2]，建立了紫杉醇亞微乳含量測定的高效液相色譜（HPLC）法，現報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀，包括G1322A型真空脫氣機、G1310A型四元泵、G1329A型自動進樣器、G1314B VWD型檢測器和 Chemstation型色譜工作站（Agilent公司）。紫杉醇對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為100382－200301）；三杉尖寧堿（紫杉醇雜質Ⅰ，中國藥品生物制品檢定所，批號為100926－200701）；7－表－10－去乙酰基紫杉醇（紫杉醇雜質Ⅱ，中國藥品生物制品檢定所，批號為100925－200701）；紫杉醇亞微乳（批號為 20110409－1，20110409－2，20110415，規(guī)格為 1.176 g/L）；空白亞微乳（輔料，按紫杉醇亞微乳的處方和工藝不加主藥制備而得，批號為 20100716）；無水乙醇（色譜純，J.T.Baker公司）；乙腈（色譜純，J＆K Chemical Ltd.）；甲醇（色譜純，Fisher Scientific 公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Zorbax XDB C18柱（250mm ×4.6mm，5 μm）；流動相：甲醇－水－乙腈（23 ∶41 ∶36）；流速：1.5 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：40℃；檢測波長：227 nm。分別取紫杉醇、三杉尖寧堿、7－表－10－去乙酰基紫杉醇對照品適量，用無水乙醇溶解制成一定濃度的溶液，分別取10 μL注入高效液相色譜儀，進行色譜峰定位。另取紫杉醇、三杉尖寧堿、7－表－10－去乙酰基紫杉醇對照品適量，用無水乙醇溶解制成質量濃度分別為 0.5，2.5，2.5 μg/mL 的混合溶液，作為系統適用性溶液，取 10 μL 注入高效液相色譜儀測定。結果三杉尖寧堿及7－表－10－去乙酰基紫杉醇與紫杉醇的相對保留時間分別為 0.89，1.09 min，分離度分別為 2.40，1.67，色譜圖見圖 1。

2.2 溶液制備

取紫杉醇適量，精密稱定，加無水乙醇溶解制成質量濃度為1.2 g/L 的貯備溶液。分別精密量取 0.8，1.0，1.2 mL（相當于供試品溶液測定濃度的80%，100%，120%）各3份，置25 mL容量瓶中，分別加入空白亞微乳（輔料）0.8，1.0，1.2 mL，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成相當于紫杉醇含量80%，100%，120%的溶液，即得空白對照溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：取空白亞微乳（輔料）1 mL，置25 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為輔料溶液，取10 μL注入高效液相色譜儀。結果表明，輔料對亞微乳的含量測定無干擾。色譜圖見圖 1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察：取紫杉醇適量，精密稱定，加無水乙醇溶解制成質量濃度為 1.2 g/L 的溶液。分別精密量取 0.2，0.5，1，1.5，2 mL，置25 mL容量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，制得質量濃度分別為 9.6，24，48，72，96 μg/mL 的標準溶液。分別取 10 μL 注入高效液相色譜儀，連續(xù)進樣3次。以質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、平均峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y＝13.788 7 X－3.424 4， r＝0.999 9（n＝5）。結果的 RSD 分別為0.12% ，0.12% ，0.10% ，0.16% ，0.08% ，表明紫杉醇樣品質量濃度在9.6～96 μg/mL范圍內與峰面積呈良好線性關系。

定量限檢測：紫杉醇質量濃度為 0.3 μg/mL，進樣量為 10 μL，其峰信號約為噪音的10倍，計算得該方法的定量限為3 ng。

重復性試驗：取同一紫杉醇亞微乳樣品6份，按擬訂方法測定紫杉醇含量。結果，樣品含量測定的 RSD為0.31%（n＝6），表明方法重現性良好。

穩(wěn)定性試驗：取供試品溶液 10 μL，分別于 0，2，4，6，8，10，12 h時進樣測定，記錄峰面積。結果的 RSD為0.16%，表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。取紫杉醇適量，精密稱定，加無水乙醇溶解制成質量濃度為 1.2 g/L 的貯備溶液。分別精密量取 0.8，1.0，1.2 mL(相當于供試品溶液測定濃度的80%，100%，120%)各3份，置25 mL 容量瓶中，分別加入空白亞微乳(輔料)0.8，1.0，1.2 mL，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成相當于紫杉醇含量80%，100%，120%的溶液，即得空白對照溶液。按擬訂方法測定，計算回收率。結果見表1。

表1 回收率測定結果（n＝9）

2.4 樣品含量測定

精密量取本品1 mL，置25 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液；另取紫杉醇對照品約22mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，振搖使溶解，精密量取1 mL，置50 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。按擬訂色譜條件，分別取10 μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，采用外標法計算含量。結果，批號為20110409－1，20110409－2，20110415的樣品中，紫杉醇的含量分別為標示量的 95.2% ，96.1% ，97.8% 。

3 討論

2010年版《中國藥典（二部）》收載了紫杉醇藥品標準，其含量測定項下的系統適用性試驗中，規(guī)定了紫杉醇峰與三杉尖寧堿（雜質Ⅰ）峰及7－表－10－去乙酰基紫杉醇（雜質Ⅱ）的分離度均應大于1.0。在流動相篩選時，在現有色譜條件下，對目前紫杉醇含量測定通常采用的3種流動相系統（甲醇－水、乙腈－水、甲醇－乙腈－水）進行了比較。結果發(fā)現，以甲醇－水、乙腈－水系統為流動相時，調整流動相比例使紫杉醇的保留時間在12 min范圍內，方法的系統適用性均不能滿足中國藥典要求。

在紫杉醇亞微乳研究中，我們采用建立的HPLC有關物質檢查法進行紫杉醇亞微乳及空白亞微乳（輔料）的強制降解試驗、影響因素試驗、加速試驗及長期試驗時發(fā)現，輔料對紫杉醇測定無干擾，亞微乳降解后主要產生2個雜質，經與美國藥典收載的紫杉醇標準中各個雜質峰的相對保留時間進行比較，并與雜質對照品的保留時間進行比對，鑒定降解產物為10－去乙酰基紫杉醇及7－表－紫杉醇。故在擬訂色譜條件下，試驗了10－去乙酰基紫杉醇及7－表－紫杉醇對紫杉醇含量測定的干擾，結果10－去乙酰基紫杉醇及7－表－紫杉醇與紫杉醇的相對保留時間分別為 0.64，1.71 min，降解產物不干擾主成分測定。因此，按照 2010年版《中國藥典（二部）》紫杉醇標準含量測定項下規(guī)定的系統適用性試驗，即可保證本品測定方法的專屬性符合要求。

亞微乳是由油、水、表面活性劑組成。由于藥物與油脂分離困難，目前亞微乳含量測定供試品溶液制備時，除少量文獻采用以高溫、堿、鹽等破乳后再用有機溶劑提取藥物的方法外，大多采用直接用有機溶劑溶解稀釋的方法。由于紫杉醇對高溫、堿不穩(wěn)定，我們前期曾參考文獻[3]，對鹽破乳后再用有機溶劑提取的方法進行了研究，但未能同時獲得紫杉醇與油脂的完全分離及合格的回收率。因此，本方法采用有機溶劑溶解稀釋的方式制備供試品溶液。對有機溶劑進行的篩選表明，在測定濃度下，甲醇、乙腈均不能溶解紫杉醇亞微乳，無法滿足紫杉醇測定濃度的要求，故選擇無水乙醇作為本品的測定溶劑。

參考文獻：

[1] Xia XJ，Guo RF，Liu YL，et al.Formulation，characterization and hypersensitivity evaluation of anintravenous emulsion loaded with a paclitaxel－cholesterol complex[J].Chem Pharm Bull（Tokyo），2011，59（3）:321－326.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：1 007－1 008.

[3] 李 萌，王杏林，葛志強，等.HPLC法測定依托泊苷亞微乳中的藥物含量[J].中國新藥雜志，2007，16（17）：1 390－1 392.