復方黃龍膠囊對凝血、纖溶功能的影響

黎淵弘 ，劉言香 ，莫冬梅，鐘小斌

（1.廣西醫科大學第一附屬醫院藥劑科，廣西 南寧 530021； 2.廣西醫科大學藥學院，廣西 南寧 530021）

復方黃龍膠囊是由黃芪、赤芍、川芎、當歸尾、地龍、紅花、桃仁、水蛭、川牛膝提取物制備而成的醫院制劑。現按中藥六類醫院制劑進行臨床前藥效學試驗，深入研究其抗凝和纖溶作用，報道如下。

1 儀器、試藥與動物

儀器:AR1140/C型電子分析天平（奧豪斯國際貿易＜上海＞有限公司）；LDZ4-0.8型自動平衡微型離心機（北京醫用離心機廠）；B11241-89型電熱恒溫水浴箱（北京醫療設備廠）；DU-3300PC型紫外可見光分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；ACL-Advace全自動血凝儀（美國IL公司）。

試藥:復方黃龍膠囊（廣西醫科大學第一附屬醫院制劑室，自制）；注射用尿激酶（廣東天普生物化學制藥有限公司，批號為20120709）；戊巴比妥鈉（上海化學試劑采購供應站分廠，批號為2012-05-08）。活化部分凝血活酶時間（APTT）測定試劑盒、凝血酶原時間（PT）測定試劑盒、凝血酶時間（TT）測定試劑盒（均為上海太陽生物技術有限公司，批號為1121121）；凍干人纖維蛋白原（上海萊士血液制品股份有限公司，批號為20070121AO）；凝血酶（河南中泰藥業有限公司，批號為20100503）。

動物:家兔，體重 2.0 ～2.5 kg；Wistar大鼠，體重 200 ～300 g。動物雌雄兼用，均由廣西醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號為SCXK桂2009-0002。

2 方法與結果

2.1 體外凝血時間測定

給藥組取復方黃龍膠囊提取物0.1 mL（含生藥60 mg），對照組加生理鹽水0.1 mL，分置兩支試管中，各加1 mL家兔動脈血，觀察凝血時間共 10次。結果對照組凝血時間為（36.40±12.62）s，給藥組為（419.60±66.52）s。復方黃龍膠囊能明顯延長動物體外凝血時間(P ＜0.05)。

2.2 血塊溶解時間測定

取家兔動脈血2 mL，置試管內12 h自然凝固后，取出血凝塊，一分為二，用濾紙吸干后稱重，分放兩支試管內；一支作為給藥組，加復方黃龍膠囊提取物0.1mL（含生藥60mg）；另一支作為對照組，加生理鹽水 0.1mL）。1.5 h后取出剩余血塊，吸干稱重。結果見表1。可見，復方黃龍膠囊能明顯溶解血塊，溶解體外塊。

表1 復方黃龍膠囊對體外血塊溶解的作用（n＝10，±s）

表1 復方黃龍膠囊對體外血塊溶解的作用（n＝10，±s）

注:t檢驗，與對照組比較，P ＜0.05。

組別對照組給藥組質量濃度（g /L）0 0.0 6血塊濕重（mg）溶解前1 0 0 1 0 0溶解后7 7.3 2 ±3.3 5 2 5.7 8 ± 4.9 1溶解率（%）2 2.6 8 ± 3.3 5 7 4.2 2 ± 4.9 1

2.3 優球蛋白溶解時間測定[1]

體外法:分離枸櫞酸鈉抗凝血漿，取離心管4支，分別加入蒸餾水 7.5 mL，加 0.17 mol/L 乙酸 0.12 mL，置冰水浴（4 ℃ ）中10min；水浴10min后加入0.5mL血漿混勻，繼續置冰水浴10min，以3 000 r/min轉速離心15 min；傾去上清液，倒置離心管于濾紙上，吸去殘余液體；加入硼酸鈉緩沖液0.5 mL于沉淀中，置37℃水浴中，輕輕攪動使之溶解；加入 0.025 mol/L CaCl25 mL，靜置凝結成凝塊；凝固后，給藥組加入不同質量濃度的復方黃龍膠囊提取物，對照組加入生理鹽水，置于37℃水浴中，記錄凝塊完全溶解的時間。

體內法:取大白鼠30只，分為大劑量組（含生藥6 g/kg）、小劑量組（含生藥3 g/kg）和對照組（等體積生理鹽水）3組，每組10只，分別灌胃給藥7 d；按以上體外法制得凝塊，分別置凝塊于37℃水浴中，記錄凝塊完全溶解的時間。

結果見表2。可見，復方黃龍膠囊體外溶解優球蛋白的效果明顯；體內雖能溶解優球蛋白，但溶解效果不如體外。

表2 大白鼠體內外優球蛋白溶解時間測定（n＝10，±s）

表2 大白鼠體內外優球蛋白溶解時間測定（n＝10，±s）

注:t檢驗，與對照組比較，P ＜0.01。

體外 體內組別劑量（g /k g）對照組大劑量組小劑量組質量濃度（g /L）-0.6 0.3溶解時間（h）4.7 1 ± 0.5 1 1.6 8 ± 0.2 8 1.8 1 ± 0.1 3-6 3溶解時間（h）凝塊不溶解5.6 3 ± 0.6 9 7.4 4 ± 0.7 9

2.4 抗凝效應試驗

體外法:由人肱動脈抽血，用3.8%枸櫞酸鈉抗凝，血液與抗凝劑之比為 9∶1，以 4 000 r/min轉速離心 15 min，取上清液，即為貧血小板血漿。給藥組取復方黃龍膠囊提取物0.1mL(含生藥60 g)，對照組取生理鹽水0.1 mL，分別加入以上述方法制備的貧血小板血漿 0.1 mL，混勻，然后取 0.1 mL，按 APTT，PT，TT試劑盒說明書進行凝血時間測定。

體內法:取大白鼠30只，分為復方黃龍膠囊大、小劑量組和生理鹽水（對照組）3組，給藥組按大劑量（含生藥 6 g/kg）、小劑量（含生藥 1.6 g/kg）給藥，對照組給予等量生理鹽水，灌胃給藥7 d。給藥 7 d后，腹腔動脈取血 2 mL，用 3.8%枸櫞酸鈉 9∶1抗凝，以 4 000 r/min 轉速離心 10 min，分離血漿，按 APTT，PT，TT試劑盒說明書進行凝血時間測定。

結果見表3和表4。可見，復方黃龍膠囊在體內外均可使APTT，PT，TT顯著延長（P ＜0.01）。

表3 復方黃龍膠囊體外對人血APTT，PT，TT的影響（±s，n＝10）

表3 復方黃龍膠囊體外對人血APTT，PT，TT的影響（±s，n＝10）

注:t檢驗，與對照組比較，P ＜0.01。

組別對照組大劑量組中劑量組小劑量組質量濃度（g /L）-1 6 8 4 A P TT（s）3 9.1 0 ± 6.2 3 3 6 0.0 0 ±0.0 0 2 2 5.7 0 ±2 8.6 6 9 3.8 0 ± 1 2.0 6 P T（s）1 7.3 0 ±2.1 1 1 8 0.0 0 ± 0.0 0 4 1.5 0 ±3.6 3 2 5.1 0 ±2.1 8 TT（s）1 4.4 0 ± 0.5 2 6 6.8 0 ± 7.5 7 3 0.6 0 ± 2.3 7 2 2.6 0 ± 1.7 1

表4 復方黃龍膠囊體內對大白鼠APTT，PT，TT的影響（±s，n＝10）

表4 復方黃龍膠囊體內對大白鼠APTT，PT，TT的影響（±s，n＝10）

注:t檢驗，與對照組比較，P ＜0.01。

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2.5 纖溶活性測定

纖溶活性測定采用纖維蛋白平板法[2]（標準平板和加熱平板）。按需在平板上打直徑為3 mm的小孔，每孔加不同質量濃度的尿激酶或復方黃龍膠囊提取物10μL（含生藥0.1mg），置37℃保溫18 h后，取出觀察結果。結果見圖1。可見，復方黃龍膠囊在普通平板和加熱平板上都能溶解纖維蛋白（有溶圈）；而尿激酶在普通平板上有較強的纖溶作用，在加熱平板上則無纖溶作用（無溶圈）。說明復方黃龍膠囊纖溶機制與尿激酶不同，是以直接纖溶為主。

圖1 復方黃龍膠囊的纖溶活性測定

3 討論

動脈血栓形成屬中醫的血瘀證范疇，以氣虛血瘀癥最常見，瘀阻經絡是其主要矛盾，治療應以化瘀通絡為重點、補氣為輔。自《黃帝內經》問世以來，防治血栓的方劑有百余種，在諸多成方中，黃芪、地龍、水蛭、川芎、牛膝這幾味藥的使用率高。據此，筆者在清代王清任《醫林改錯》中“補陽還五湯”的基礎上，補加水蛭、川牛膝兩味藥材，目的在于加大祛瘀通絡藥物的比例，引血下行。復方黃龍膠囊由黃芪、赤芍、川芎、當歸尾、地龍、紅花、桃仁、水蛭、川牛膝組方方中重用黃芪，取其大補脾胃之元氣，使氣旺以促血行，祛瘀而不傷正，并助諸藥之力，為君藥；配以當歸尾，有祛瘀而不傷好血之妙，為臣藥；川芎、赤芍、紅花、桃仁、助當歸尾活血化瘀，地龍、水蛭、川牛膝通經活絡，均為佐使藥。全方功能補氣、活血、通經絡。

現代醫學研究表明，黃芪[3]能降低血液的高凝狀態，使糖尿病大鼠的全血黏度、血漿黏度、紅細胞壓積以及血小板聚集率均顯著降低。阿魏酸[4]是當歸的有效成分之一，能有效抑制血小板聚集，抑制5-羥色胺、血栓素樣物質的釋放和血栓素合成酶的活性，使前列腺素和血栓素的比例升高，從而發揮抗血栓作用。赤芍[5]能抑制血小板聚集，改善紅細胞的通透性，增加紅細胞對低滲張力的抗性，有一定穩定紅細胞膜結構的作用。另外，赤芍總苷能明顯延長大鼠和小鼠的凝血時間。地龍含有蚓激酶[6]，能直接水解纖維蛋白，并能間接激活纖溶酶原形成纖溶酶，起到纖溶酶原激活物的作用。水蛭[7]的藥效成分水蛭素是迄今發現的作用最強的凝血酶抑制劑之一，能明顯延長APTT，PT及TT，抑制凝血因子Ⅱ，Ⅷ，Ⅹ，Ⅻ的活性，具有很強的抗凝活性。川芎的有效成分川芎嗪[8]可保護血管內皮，阻斷Ca2+對血小板的激活和前列腺素的代謝，顯著減輕缺血再灌注損傷后內皮細胞與白細胞的黏附，促進血管內皮細胞釋放一氧化氮（NO），從而抑制血小板聚集。紅花[9]中的紅花黃色素（SY）對內源性凝血和外源性凝血均有明顯的抑制作用，可顯著延長PT和TT，對凝血過程中的血小板黏附、血栓形成、纖維蛋白交聯等均有抑制作用。桃仁[10]水提物、苦杏仁苷、桃仁脂肪油對二磷酸腺苷（ADP）誘導的血小板聚集都有不同程度的抑制作用，能顯著降低由高分子右旋糖酐引起的家兔實驗性高黏滯血癥，并能降低紅細胞的聚集性。牛膝[11]具有降低大鼠全血黏度、紅細胞壓積、紅細胞聚集指數的作用，并能延長大鼠PT和血漿復鈣時間，從而產生抗凝血作用。

本試驗結果表明，復方黃龍膠囊在體內外均能明顯延長人和大白鼠 APTT，PT，TT，縮短家兔的 BLT，ELT；在普通纖維蛋白平板和加熱平板上能溶解纖維蛋白。因此，復方黃龍膠囊具有抗凝和纖溶雙重作用，主要是由于其主要成分對凝血功能多個環節和多個靶點產生協同的抑制作用。

參考文獻:

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