復(fù)方黃龍膠囊對凝血、纖溶功能的影響

黎淵弘 ，劉言香 ，莫冬梅，鐘小斌

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，廣西 南寧 530021； 2.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021）

復(fù)方黃龍膠囊是由黃芪、赤芍、川芎、當(dāng)歸尾、地龍、紅花、桃仁、水蛭、川牛膝提取物制備而成的醫(yī)院制劑。現(xiàn)按中藥六類醫(yī)院制劑進(jìn)行臨床前藥效學(xué)試驗(yàn)，深入研究其抗凝和纖溶作用，報道如下。

1 儀器、試藥與動物

儀器:AR1140/C型電子分析天平（奧豪斯國際貿(mào)易＜上海＞有限公司）；LDZ4-0.8型自動平衡微型離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；B11241-89型電熱恒溫水浴箱（北京醫(yī)療設(shè)備廠）；DU-3300PC型紫外可見光分光光度計（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；ACL-Advace全自動血凝儀（美國IL公司）。

試藥:復(fù)方黃龍膠囊（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室，自制）；注射用尿激酶（廣東天普生物化學(xué)制藥有限公司，批號為20120709）；戊巴比妥鈉（上海化學(xué)試劑采購供應(yīng)站分廠，批號為2012-05-08）。活化部分凝血活酶時間（APTT）測定試劑盒、凝血酶原時間（PT）測定試劑盒、凝血酶時間（TT）測定試劑盒（均為上海太陽生物技術(shù)有限公司，批號為1121121）；凍干人纖維蛋白原（上海萊士血液制品股份有限公司，批號為20070121AO）；凝血酶（河南中泰藥業(yè)有限公司，批號為20100503）。

動物:家兔，體重 2.0 ～2.5 kg；Wistar大鼠，體重 200 ～300 g。動物雌雄兼用，均由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號為SCXK桂2009-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 體外凝血時間測定

給藥組取復(fù)方黃龍膠囊提取物0.1 mL（含生藥60 mg），對照組加生理鹽水0.1 mL，分置兩支試管中，各加1 mL家兔動脈血，觀察凝血時間共 10次。結(jié)果對照組凝血時間為（36.40±12.62）s，給藥組為（419.60±66.52）s。復(fù)方黃龍膠囊能明顯延長動物體外凝血時間(P ＜0.05)。

2.2 血塊溶解時間測定

取家兔動脈血2 mL，置試管內(nèi)12 h自然凝固后，取出血凝塊，一分為二，用濾紙吸干后稱重，分放兩支試管內(nèi)；一支作為給藥組，加復(fù)方黃龍膠囊提取物0.1mL（含生藥60mg）；另一支作為對照組，加生理鹽水 0.1mL）。1.5 h后取出剩余血塊，吸干稱重。結(jié)果見表1?？梢?，復(fù)方黃龍膠囊能明顯溶解血塊，溶解體外塊。

表1 復(fù)方黃龍膠囊對體外血塊溶解的作用（n＝10，±s）

表1 復(fù)方黃龍膠囊對體外血塊溶解的作用（n＝10，±s）

注:t檢驗(yàn)，與對照組比較，P ＜0.05。

組別對照組給藥組質(zhì)量濃度（g /L）0 0.0 6血塊濕重（mg）溶解前1 0 0 1 0 0溶解后7 7.3 2 ±3.3 5 2 5.7 8 ± 4.9 1溶解率（%）2 2.6 8 ± 3.3 5 7 4.2 2 ± 4.9 1

2.3 優(yōu)球蛋白溶解時間測定[1]

體外法:分離枸櫞酸鈉抗凝血漿，取離心管4支，分別加入蒸餾水 7.5 mL，加 0.17 mol/L 乙酸 0.12 mL，置冰水?。? ℃ ）中10min；水浴10min后加入0.5mL血漿混勻，繼續(xù)置冰水浴10min，以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min；傾去上清液，倒置離心管于濾紙上，吸去殘余液體；加入硼酸鈉緩沖液0.5 mL于沉淀中，置37℃水浴中，輕輕攪動使之溶解；加入 0.025 mol/L CaCl25 mL，靜置凝結(jié)成凝塊；凝固后，給藥組加入不同質(zhì)量濃度的復(fù)方黃龍膠囊提取物，對照組加入生理鹽水，置于37℃水浴中，記錄凝塊完全溶解的時間。

體內(nèi)法:取大白鼠30只，分為大劑量組（含生藥6 g/kg）、小劑量組（含生藥3 g/kg）和對照組（等體積生理鹽水）3組，每組10只，分別灌胃給藥7 d；按以上體外法制得凝塊，分別置凝塊于37℃水浴中，記錄凝塊完全溶解的時間。

結(jié)果見表2?？梢?，復(fù)方黃龍膠囊體外溶解優(yōu)球蛋白的效果明顯；體內(nèi)雖能溶解優(yōu)球蛋白，但溶解效果不如體外。

表2 大白鼠體內(nèi)外優(yōu)球蛋白溶解時間測定（n＝10，±s）

表2 大白鼠體內(nèi)外優(yōu)球蛋白溶解時間測定（n＝10，±s）

注:t檢驗(yàn)，與對照組比較，P ＜0.01。

體外 體內(nèi)組別劑量（g /k g）對照組大劑量組小劑量組質(zhì)量濃度（g /L）-0.6 0.3溶解時間（h）4.7 1 ± 0.5 1 1.6 8 ± 0.2 8 1.8 1 ± 0.1 3-6 3溶解時間（h）凝塊不溶解5.6 3 ± 0.6 9 7.4 4 ± 0.7 9

2.4 抗凝效應(yīng)試驗(yàn)

體外法:由人肱動脈抽血，用3.8%枸櫞酸鈉抗凝，血液與抗凝劑之比為 9∶1，以 4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心 15 min，取上清液，即為貧血小板血漿。給藥組取復(fù)方黃龍膠囊提取物0.1mL(含生藥60 g)，對照組取生理鹽水0.1 mL，分別加入以上述方法制備的貧血小板血漿 0.1 mL，混勻，然后取 0.1 mL，按 APTT，PT，TT試劑盒說明書進(jìn)行凝血時間測定。

體內(nèi)法:取大白鼠30只，分為復(fù)方黃龍膠囊大、小劑量組和生理鹽水（對照組）3組，給藥組按大劑量（含生藥 6 g/kg）、小劑量（含生藥 1.6 g/kg）給藥，對照組給予等量生理鹽水，灌胃給藥7 d。給藥 7 d后，腹腔動脈取血 2 mL，用 3.8%枸櫞酸鈉 9∶1抗凝，以 4 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心 10 min，分離血漿，按 APTT，PT，TT試劑盒說明書進(jìn)行凝血時間測定。

結(jié)果見表3和表4?？梢?，復(fù)方黃龍膠囊在體內(nèi)外均可使APTT，PT，TT顯著延長（P ＜0.01）。

表3 復(fù)方黃龍膠囊體外對人血APTT，PT，TT的影響（±s，n＝10）

表3 復(fù)方黃龍膠囊體外對人血APTT，PT，TT的影響（±s，n＝10）

注:t檢驗(yàn)，與對照組比較，P ＜0.01。

組別對照組大劑量組中劑量組小劑量組質(zhì)量濃度（g /L）-1 6 8 4 A P TT（s）3 9.1 0 ± 6.2 3 3 6 0.0 0 ±0.0 0 2 2 5.7 0 ±2 8.6 6 9 3.8 0 ± 1 2.0 6 P T（s）1 7.3 0 ±2.1 1 1 8 0.0 0 ± 0.0 0 4 1.5 0 ±3.6 3 2 5.1 0 ±2.1 8 TT（s）1 4.4 0 ± 0.5 2 6 6.8 0 ± 7.5 7 3 0.6 0 ± 2.3 7 2 2.6 0 ± 1.7 1

表4 復(fù)方黃龍膠囊體內(nèi)對大白鼠APTT，PT，TT的影響（±s，n＝10）

表4 復(fù)方黃龍膠囊體內(nèi)對大白鼠APTT，PT，TT的影響（±s，n＝10）

注:t檢驗(yàn)，與對照組比較，P ＜0.01。

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2.5 纖溶活性測定

纖溶活性測定采用纖維蛋白平板法[2]（標(biāo)準(zhǔn)平板和加熱平板）。按需在平板上打直徑為3 mm的小孔，每孔加不同質(zhì)量濃度的尿激酶或復(fù)方黃龍膠囊提取物10μL（含生藥0.1mg），置37℃保溫18 h后，取出觀察結(jié)果。結(jié)果見圖1?？梢?，復(fù)方黃龍膠囊在普通平板和加熱平板上都能溶解纖維蛋白（有溶圈）；而尿激酶在普通平板上有較強(qiáng)的纖溶作用，在加熱平板上則無纖溶作用（無溶圈）。說明復(fù)方黃龍膠囊纖溶機(jī)制與尿激酶不同，是以直接纖溶為主。

圖1 復(fù)方黃龍膠囊的纖溶活性測定

3 討論

動脈血栓形成屬中醫(yī)的血瘀證范疇，以氣虛血瘀癥最常見，瘀阻經(jīng)絡(luò)是其主要矛盾，治療應(yīng)以化瘀通絡(luò)為重點(diǎn)、補(bǔ)氣為輔。自《黃帝內(nèi)經(jīng)》問世以來，防治血栓的方劑有百余種，在諸多成方中，黃芪、地龍、水蛭、川芎、牛膝這幾味藥的使用率高。據(jù)此，筆者在清代王清任《醫(yī)林改錯》中“補(bǔ)陽還五湯”的基礎(chǔ)上，補(bǔ)加水蛭、川牛膝兩味藥材，目的在于加大祛瘀通絡(luò)藥物的比例，引血下行。復(fù)方黃龍膠囊由黃芪、赤芍、川芎、當(dāng)歸尾、地龍、紅花、桃仁、水蛭、川牛膝組方方中重用黃芪，取其大補(bǔ)脾胃之元?dú)猓箽馔源傺校铕龆粋⒅T藥之力，為君藥；配以當(dāng)歸尾，有祛瘀而不傷好血之妙，為臣藥；川芎、赤芍、紅花、桃仁、助當(dāng)歸尾活血化瘀，地龍、水蛭、川牛膝通經(jīng)活絡(luò)，均為佐使藥。全方功能補(bǔ)氣、活血、通經(jīng)絡(luò)。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，黃芪[3]能降低血液的高凝狀態(tài)，使糖尿病大鼠的全血黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞壓積以及血小板聚集率均顯著降低。阿魏酸[4]是當(dāng)歸的有效成分之一，能有效抑制血小板聚集，抑制5-羥色胺、血栓素樣物質(zhì)的釋放和血栓素合成酶的活性，使前列腺素和血栓素的比例升高，從而發(fā)揮抗血栓作用。赤芍[5]能抑制血小板聚集，改善紅細(xì)胞的通透性，增加紅細(xì)胞對低滲張力的抗性，有一定穩(wěn)定紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的作用。另外，赤芍總苷能明顯延長大鼠和小鼠的凝血時間。地龍含有蚓激酶[6]，能直接水解纖維蛋白，并能間接激活纖溶酶原形成纖溶酶，起到纖溶酶原激活物的作用。水蛭[7]的藥效成分水蛭素是迄今發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的凝血酶抑制劑之一，能明顯延長APTT，PT及TT，抑制凝血因子Ⅱ，Ⅷ，Ⅹ，Ⅻ的活性，具有很強(qiáng)的抗凝活性。川芎的有效成分川芎嗪[8]可保護(hù)血管內(nèi)皮，阻斷Ca2+對血小板的激活和前列腺素的代謝，顯著減輕缺血再灌注損傷后內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞的黏附，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放一氧化氮（NO），從而抑制血小板聚集。紅花[9]中的紅花黃色素（SY）對內(nèi)源性凝血和外源性凝血均有明顯的抑制作用，可顯著延長PT和TT，對凝血過程中的血小板黏附、血栓形成、纖維蛋白交聯(lián)等均有抑制作用。桃仁[10]水提物、苦杏仁苷、桃仁脂肪油對二磷酸腺苷（ADP）誘導(dǎo)的血小板聚集都有不同程度的抑制作用，能顯著降低由高分子右旋糖酐引起的家兔實(shí)驗(yàn)性高黏滯血癥，并能降低紅細(xì)胞的聚集性。牛膝[11]具有降低大鼠全血黏度、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞聚集指數(shù)的作用，并能延長大鼠PT和血漿復(fù)鈣時間，從而產(chǎn)生抗凝血作用。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方黃龍膠囊在體內(nèi)外均能明顯延長人和大白鼠 APTT，PT，TT，縮短家兔的 BLT，ELT；在普通纖維蛋白平板和加熱平板上能溶解纖維蛋白。因此，復(fù)方黃龍膠囊具有抗凝和纖溶雙重作用，主要是由于其主要成分對凝血功能多個環(huán)節(jié)和多個靶點(diǎn)產(chǎn)生協(xié)同的抑制作用。

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