蘆薈大黃素對人永生化角質形成細胞增殖和凋亡作用研究

曾德貴 ，莫衍石 ，劉榮豐 ，楊春燕 ，林世平 ，陳小誼 ，蘭柳波

（1.廣東省深圳市慢性病防治中心，廣東 深圳 518020； 2.廣東醫學院生物化學與分子生物學研究所，廣東 湛江 524023）

蘆薈（aloe）屬多年生常綠肉質草本植物，具有很高的藥用價值，性苦、寒，可清肝熱、通便[1]。現代醫學研究發現，蘆薈的藥用有效成分十分復雜，主要有大黃素、大黃酚、蒽醌等物質，其中起抑菌作用的成分主要是蘆薈大黃素生物活性物質[2]。銀屑病是由于角質形成細胞過度增殖引起的一種具有遺傳傾向的炎癥性增殖性皮膚病，臨床缺乏有效的治療藥物。目前尚未見關于蘆薈用于臨床治療銀屑病的報道，但有研究報道了蘆薈對銀屑病患者外周血單核細胞和角質形成細胞增殖的影晌[3-5]。人永生化角質形成細胞HaCaT是一種永生化的角質形成細胞株，具有永生性和與角質形成細胞相似的增殖、分化特性，遺傳特性穩定，不具有成瘤性，常用來替代人表皮角質形成細胞進行研究[6]，是研究藥物治療銀屑病療效常用的體外細胞模型。本研究中擬從蘆薈中提取蘆薈大黃素，檢測其對HaCaT細胞增殖能力、細胞形態、細胞周期及凋亡的影響，從而為蘆薈治療銀屑病提供藥理學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

旋轉蒸發器（EYELA，上海愛朗儀器有限公司）；全自動酶標儀、低速離心機（美國Sigma公司）；倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）；流式細胞儀（美國BD公司 FAC scalibur流式細胞儀）；CO2細胞培養箱（日本三洋公司）。蘆薈采自廣東徐聞縣境內；對照品蘆薈大黃素購自中國藥品生物制品檢定所（787-9001）。人角質形成細胞（HaCaT細胞）購自中國典藏培養物保藏中心。DMEM培養基、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）均購自美國Gibco公司；胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司；胰蛋白酶(Gibco公司)。PI染色試劑盒（聯科生物）。

1.2 方法

1.2.1 蘆薈大黃素的提取與制備

取中藥材蘆薈約100 g，洗凈、粉碎、酸化后風干，用本課題組建立的工藝路線提取得到蘆薈大黃素提取物。經鑒定，其成分的分子結構與對照品蘆薈大黃素一致。用DMSO溶解配制成質量濃度為 10 g/L的蘆薈大黃素提取物藥液，用 0.22μm微孔濾膜過濾除菌，試驗前用細胞培養液稀釋成所需質量濃度，DMSO終濃度小于或等于 0.1%（V/V）。試驗表明，該濃度對細胞生長無影響。

1.2.2 細胞培養

將 HaCaT細胞以5×105個/mL接種于含 10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM培養基，置37℃及5%CO2培養箱。在細胞數達1×109/mL前用完全培養基重新懸浮，并以1∶3的比例傳代，取對數生長期細胞進行試驗。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖

取對數生長期 HaCaT細胞，以2.0×104mL接種于96孔培養板中，每孔100μL；接種24h后分別加入不同質量濃度藥物，使蘆薈大黃素終質量濃度分別為20，40，80μg/mL，每個質量濃度設3～5個平行孔，并設空白對照組、溶劑對照組；給藥48 h后，每孔加入 20 μLMTT（5 g/L），繼續培養 4 h，棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗板1次，再加入 DMSO，每孔 100μL，室溫震蕩搖勻10 min，用酶標儀在492 nm波長處測定吸光度（OD）值，并計算增殖抑制率。抑制率（%）＝（1-給藥組 OD值/對照組OD值）×100%。

1.2.4 倒置顯微鏡觀察細胞形態學變化

取對數生長期細胞，接種于25 cm2的培養瓶，當細胞長滿培養瓶底約60%時置于光學顯微鏡下觀察細胞形態后加藥。設空白對照組，培養24 h后，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化并作記錄。

1.2.5 流式細胞術檢測蘆薈大黃素對HaCaT細胞周期的影響

取對數期生長狀態良好的HaCaT細胞，制成單個細胞懸液，以每孔約104個細胞接種于6孔培養板上，待細胞生長融合到70%～80%時，加入不同質量濃度的蘆薈大黃素，每個藥物質量濃度設3個平行孔。作用48 h后用胰酶消化，收集細胞，并用無血清培養基洗滌細胞兩次后用100μL無血清培養基重懸細胞，加入預冷的70%乙醇，4℃固定。上機前離心，去上清，并用PBS 5 000 r/min洗滌細胞2次，每次5 min。分別在每個樣品中加入100μL RNaseA，于37℃溫水中水浴30 min后加入PI進行染色，4℃避光30min后，上流式細胞儀檢測細胞周期。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 蘆薈大黃素對HaCaT細胞增殖的影響

MTT檢測結果顯示，蘆薈大黃素可顯著抑制體外培養的Ha-Cat細胞的生長，且隨著藥物質量濃度增加抑制作用增強，即呈一定范圍的劑量依賴性，見表1。可見，不同質量濃度藥物組吸光度明顯減少，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 蘆薈大黃素作用于HaCaT細胞48 h的抑制效應（±s，n＝3）

表1 蘆薈大黃素作用于HaCaT細胞48 h的抑制效應（±s，n＝3）

組別對照組0.1%D M S O 組低劑量組中劑量組高劑量組質量濃度（ g/mL）--2 0 4 0 8 0 O D 492 2.3 0 ± 0.1 2 2.3 4 ± 0.0 8 1.9 1 ± 0.1 7 0.9 0 ± 0.1 8 0.7 6 ± 0.1 5抑制率（%）0.0 0-2.0 0 1 6.9 5 6 0.0 8 6 6.9 5

2.2 細胞形態學觀察

在倒置顯微鏡下觀察，空白對照組細胞數量多，密度大，細胞呈梭形或不規則形，折光性強；經一定質量濃度蘆薈大黃素處理后細胞數量明顯減少，細胞體積變小、變形，出現皺縮、變圓、脫落，細胞折光性減低。

2.3 細胞凋亡的流式細胞儀分析

不同質量濃度的蘆薈大黃素作用于HaCaT細胞48 h后，S期細胞與對照組相比明顯增加，G0/G1期比例降低，可見藥物將細胞阻滯于S期。見表2。

表2 蘆薈大黃素作用于HaCaT細胞48 h后對細胞周期的影響（±s，n＝3）

表2 蘆薈大黃素作用于HaCaT細胞48 h后對細胞周期的影響（±s，n＝3）

注:與對照組相比，P ＜0.05。

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組質量濃度（ g/mL）-2 0 4 0 8 0 G 0/G 1 2 5.8 1 3.7 1 5.4 1 1.6 S 5 0.3 6 4.0 5 9.1 7 2.5 G 2/M 2 3.8 2 2.4 2 5.5 1 6.0

3 討論

銀屑病是常見慢性炎癥性皮膚病，頑固且易復發。研究表明，銀屑病大多表現為角質形成細胞過度增殖及異常分化。細胞凋亡與增殖是生物體內一對并存的矛盾，正常情況下二者維持動態平衡，因而細胞凋亡與增殖變化緊密相關。多數學者認為，銀屑病患者皮損中角質形成細胞的凋亡受阻，在銀屑病中表達異常，并且與銀屑病角質形成細胞過度增生、炎癥細胞浸潤有關。在銀屑病發病相關的角質形成細胞凋亡研究中，一般均使用HaCat細胞作為正常角質形成細胞模型[7]。本研究中，采用體外培養的HaCaT細胞，研究蘆薈大黃素對HaCaT細胞增殖能力的影響，試驗分別采用MTT法檢測細胞生長狀況、倒置顯微鏡進行形態學觀察，以及流式細胞儀檢測細胞周期。細胞的增殖力、形態、細胞周期3個方面變化的結果表明，蘆薈大黃素對HaCaT細胞的作用具有一定范圍內的劑量依賴關系，但這種依賴并非簡單線性關系，而是呈現出隨機非線性的特點。在低質量濃度藥物時幾乎不影響HaCaT細胞生長，但用高質量濃度藥物處理細胞后，其生長受到明顯抑制，甚至出現大部分凋亡、裂解成碎片的現象。

采用流式細胞術對細胞周期的研究結果表明，不同質量濃度的蘆薈大黃素均能降低細胞G1期時相的比例，使S期時相的比例上升，而將細胞阻滯于S期(即DNA合成期)，即其可能通過阻止細胞的DNA合成來抑制細胞增殖，從而抑制細胞有絲分裂并誘導其凋亡。

綜上所述，蘆薈大黃素質量濃度在20～80μg/mL范圍內能明顯抑制HaCaT細胞的增殖，且抑制能力隨藥物質量濃度升高而增強；并可通過將細胞阻滯于S期誘導其凋亡。此作用機理為應用蘆薈大黃素治療提供了藥理學依據，但由于體內外試驗的差異，其臨床治療銀屑病的機制尚需進一步的研究。

參考文獻:

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[4]徐麗敏，李 虹，毛舒和，等.蘆薈對銀屑病患者外周血單一核細胞產生干擾素- 的影響[J].中國中西醫結合皮膚性病學雜志，2003，2（3）:162-163.

[5]徐麗敏，王彥紅，李 虹，等.蘆薈對銀屑病患者外周血單核細胞和角質形成細胞增殖和凋亡的影響[J].中國中西醫結合皮膚性病學雜志，2005，4（4）:123-125.

[6]余靖宏，趙瑞芝，盧傳堅.銀屑靈優化方對銀屑病豚鼠及炎性刺激角質形成細胞增殖的影響[J].中華中醫藥雜志，2013，28（5）:1 531-1 534.

[7]陳小娥，駱 丹.角質形成細胞的凋亡失調及相關皮膚病[J].國際皮膚性病學雜志，2007，33（2）:101-103.