前列地爾脂微球注射液中游離藥物濃度測(cè)定方法研究

馬玉樊，盧婷利，崔 晗，周四元，陳 濤，

（1.西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，陜西 西安 710072； 2.中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)，陜西 西安 710032）

前列地爾即前列腺素 E1（PGE1），是一種廣泛存在于體內(nèi)的生物活性物質(zhì)，具有舒張血管平滑肌、改善血液循環(huán)、調(diào)血脂、降低血黏度及一定的直接溶栓作用。將其制備成制劑，在治療糖尿病神經(jīng)病變及腦血管病領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用。PGE1在水溶液中易水解，分散于水溶液中的PGE1在體內(nèi)能被快速滅活，故無(wú)法產(chǎn)生預(yù)期的治療效果。PGE1可很好地分散在油相中，據(jù)此特性將其開發(fā)成為前列地爾脂微球（Lipo-PGE1）制劑，成功克服了PGE1水針劑穩(wěn)定性差以及體內(nèi)代謝快的缺點(diǎn)[1-3]。Lipo-PGE1可有效地將PGE1輸送到血管病變部位，使局部藥物濃度顯著升高，產(chǎn)生良好的治療效果[4]。目前Lipo-PGE1制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅要求對(duì)藥物含量進(jìn)行測(cè)定，但對(duì)于脂微球包裹藥物的量和游離藥物并未作出相關(guān)的技術(shù)要求。大量研究顯示，Lipo-PGE1中游離的PGE1含量是決定PGE1藥效強(qiáng)度及不良反應(yīng)的最重要因素。本試驗(yàn)中建立了檢測(cè)Lipo-PGE1中游離PGE1含量的方法，分別采用不同規(guī)格的超濾膜、以不同離心速率對(duì)前列地爾脂微球樣品進(jìn)行處理，分別檢測(cè)了目前市售不同廠家的Lipo-PGE1制劑，并在此基礎(chǔ)上建立了一種可快速準(zhǔn)確分析Lipo-PGE1制劑中游離PGE1含量的新方法。

1 儀器與試藥

離心機(jī)（Beckman coulter， Microfuge 22R centrifuge）； Waters Quattro Premier型號(hào)液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，馬爾文Zeta激光粒度和ZETA電位儀；Millipore超濾離心管3K，10K，30K（上海肯強(qiáng)儀器有限公司）。前列地爾注射液（樣品1，商品名為凱時(shí)，北京泰德制藥有限公司，批號(hào)為2010N，規(guī)格為2 mL∶10μg；樣品2，商品名為喜通，西安力邦制藥有限公司，批號(hào)為1012281，規(guī)格為 2 mL∶10μg）。前列地爾標(biāo)準(zhǔn)品（上海瑞齊生物科技有限公司，批號(hào)為140659，規(guī)格為每支8mg）；甲醇、乙腈為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 Lipo-PGE1樣品表征

取Lipo-PGE1樣品，用超純水稀釋1 000倍，用激光粒度儀檢測(cè)平均粒徑。取Lipo-PGE1樣品100μL，置10 mL容量瓶中，用甲醇破乳定容，制成50 ng/mL甲醇溶液，液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)樣品中PGE1，響應(yīng)值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算 PGE1含量。結(jié)果見(jiàn)表1。可見(jiàn)，樣品1、樣品2脂微球的粒徑和含量接近。

表1 不同Lipo-PGE1樣品粒徑、含量檢測(cè)結(jié)果

2.2 樣品處理方法

超濾膜分子量的選擇:分別移取樣品1 500μL，置3，10，30 K分子量超濾離心管中，配平，以5 000 r/min的速率 4℃離心30 min，觀察下清液外觀，量取下清液體積。結(jié)果見(jiàn)表2。可見(jiàn)，使用3 K分子量超濾管離心，分子量過(guò)小，離心下清液體積過(guò)少，不易檢測(cè)含量；30 K分子量超濾管分子量過(guò)大，有小分子量的乳滴離心到下清液中，影響含量的測(cè)定。故選定10 K分子量的超濾管。

離心速度的選擇:分別移取樣品1 500μL，置10 K分子量超濾離心管中，配平后置離心機(jī)中以3 000，5 000，8 000 r/min的速率4℃各離心30 min，觀察下清液外觀，量取下清液，液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)，每個(gè)轉(zhuǎn)速下處理3個(gè)樣品，測(cè)定吸收峰面積，最后取平均值。結(jié)果見(jiàn)表 3。可見(jiàn)，3000 r/min 轉(zhuǎn)速過(guò)低，無(wú)下清液離出；8 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心下清液中游離PGE1含量測(cè)定的重現(xiàn)性不好，可能是由于轉(zhuǎn)速過(guò)高有少量的小分子量的乳滴離出；5 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心下清液中游離PGE1含量測(cè)定重現(xiàn)性好，較穩(wěn)定。因此，轉(zhuǎn)速取 5 000 r/min。

表2 使用不同分子量的超濾管離心下清液情況

表3 不同轉(zhuǎn)速下離心Lipo-PGE1下清液情況

2.3 樣品中游離藥物含量測(cè)定

2.3.1 檢測(cè)條件

色譜條件:色譜柱為 Xterra MS C18柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈 -水(85 ∶15)；流速為 0.3 mL/min；柱溫室溫；進(jìn)樣量 2μL。

質(zhì)譜條件:電噴霧電離源（ESI），以選擇反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（SRM）方式進(jìn)行檢測(cè)；電噴霧電壓為3.5 kV，加熱毛細(xì)管溫度為350℃，鞘氣（N2）流速為 10.0 L/min，輔助氣（N2）流速為 1.7 L/min，碰撞氣（Ar）壓力為0.1 Pa；碰撞能量為12 eV；用于定量分析的反應(yīng)離子為 m/z353.0 → 317.0，掃描時(shí)間為 0.1 s。

2.3.2 樣品檢測(cè)方法

樣品1、樣品2各取500μL，置一定分子量的超濾離心管內(nèi)，配平，以5 000 r/min的速率4℃離心30min，取下清液液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)游離PGE1質(zhì)量濃度，每個(gè)樣品處理3個(gè)平行樣品，檢測(cè)后取平均值。

2.3.3 方法學(xué)考察

專屬性考察:PGE1在擬訂的色譜條件下出峰良好，出峰時(shí)間為 1.38 min，見(jiàn)圖 1。離心下清液中其他成分不干擾 PGE1的測(cè)定，故方法具有較強(qiáng)的專屬性。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:精確稱取25 mg PGE1標(biāo)準(zhǔn)品，置25 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，制備1 g/L的PGE1溶液。然后用甲醇稀釋制備 1 μg/mL 的 PGE1貯備液。移液槍分別量取 10，20，30，40，50，60，80μL 的 1μg/mL 的 PGE1貯備液，再量取一定量的甲醇定容至 1mL，則分別制得 10，20，30，40，50，60，80 ng/mL 的 PGE1標(biāo)準(zhǔn)溶液。取各標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣檢測(cè)，以樣品響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，PGE1標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)做圖，得線性方程為 Y＝5.758 6X+7.127 5，r＝0.997 2(n＝7)。結(jié)果表明，前列地爾質(zhì)量濃度在 5 ～60 ng/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。以 S/N＞3計(jì)，最低檢出限為5 ng/mL。取50 ng/mL的前列地爾標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣分析6次，測(cè)定響應(yīng)值，計(jì)算得響應(yīng)值的 RSD為0.73%。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一份離心下清液樣品，分別于 0，1，2，3，4，5 h時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果的 RSD為0.43%(n＝6)，說(shuō)明供試品在5 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批樣品6份，按照樣品處理過(guò)程離心取下清液，測(cè)定 PGE1含量。結(jié)果的 RSD為0.96%，表明方法重現(xiàn)性良好。

加樣回收試驗(yàn):精密吸取空白脂肪乳離心下清液適量，精確加入PGE1標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，使其最終質(zhì)量濃度為含量測(cè)定中樣品濃度的80%，100%，120%，每個(gè)濃度制備3個(gè)樣品，依法測(cè)定。結(jié)果其平均回收率分別為 96.3%，97.1%，95.9%，RSD 分別為 1.01% ，0.70% ，0.93% 。

2.3.4 游離 PGE1濃度檢測(cè)結(jié)果

取Lipo-PGE1樣品100μL，置10 mL容量瓶中，用甲醇破乳定容，制成50 ng/mL甲醇溶液，液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)樣品中 PGE1，把檢測(cè)到的樣品響應(yīng)值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算得游離前列地爾的質(zhì)量濃度，結(jié)果見(jiàn)表4。可見(jiàn)，樣品1中游離PGE1含量顯著大于樣品2。

表4 不同PGE1樣品中游離藥物檢測(cè)結(jié)果

3 討論

大量研究顯示，Lipo-PGE1中游離的PGE1含量是決定PGE1藥效強(qiáng)度的最重要因素。Yamauchi等[6]發(fā)現(xiàn)，Lipo-PGE1的治療效果會(huì)隨著其游離PGE1含量的改變而相應(yīng)改變。Yukiko等[7]人分別用生理鹽水和脂肪乳稀釋的Lipo-PGE1進(jìn)行大鼠試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用生理鹽水稀釋的Lipo-PGE1藥效降低，而用脂肪乳稀釋的Lipo-PGE1藥效不變。關(guān)于這一現(xiàn)象的解釋有2種:一者可能是由于PGE1在生理鹽水中不穩(wěn)定，但已有研究表明PGE1在20℃生理鹽水中放置9 d后，僅有極少量的PGE1分解[8]，90%的PGE1仍穩(wěn)定存在。另外一種解釋是當(dāng)用生理鹽水或其他水溶液稀釋Lipo-PGE1時(shí)PGE1從脂肪乳中釋放出來(lái)的速率增加[9]，結(jié)合的PGE1量減少，因此輸送到病變部位的PGE1量減少，藥效降低。研究發(fā)現(xiàn)，Lipo-PGE1用生理鹽水稀釋10倍后包合的PGE1量迅速減少了53.2%，而用脂肪乳稀釋的 Lipo-PGE1中包合的PGE1量?jī)H損失了13%[10]。

2010年版《中國(guó)藥典(二部)》收載的PGE1檢測(cè)方法為經(jīng)氫氧化鈉異構(gòu)化后采用高效液相色譜在214 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)[11-12]。該方法堿異構(gòu)化耗時(shí)較長(zhǎng)，樣品處理?xiàng)l件要求高，經(jīng)過(guò)衍生處理后樣品分析靈敏度受限，因此無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)Lipo-PGE1中游離PGE1含量的檢測(cè)，且目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)并無(wú)相關(guān)檢測(cè)方法的報(bào)道。考慮到Lipo-PGE1中游離PGE1含量對(duì)Lipo-PGE1制劑藥效影響，開發(fā)出了檢測(cè) Lipo-PGE1中游離PGE1的方法。該方法采用膜分離技術(shù)將脂微球注射液進(jìn)行相分離，通過(guò)驗(yàn)證確認(rèn)適合相分離的膜材孔徑，并且考察了分離轉(zhuǎn)速對(duì)分離效果的影響。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證確認(rèn)，該方法科學(xué)簡(jiǎn)便、檢測(cè)高效、靈敏度高。

參考文獻(xiàn):

[1]Talosi G，Katona M，Racz K，et al.Prostaglandin E1 treatment in patent ductus arteriosus dependent congenital heart defects[J].J Perinat Med，2004，32（4）:368.

[2]Makita S，Nakamura M，Ohhira A，et al.Effects of prostaglandin E1 infusion on limb hemodynamics and vasodilatory response in patientswith arteriosclerosis obliterans[J].Cardiovasc Drugs Ther，1997，11（3）:441.

[3]CawelloW，Schweer H，Dietrich B，et al.Pharmacokinetics of prostaglandin E1 and itsmain metabolites after intracavernous injection and shor-terminfusion of prostaglandin E1 in patients with erectile dysfunction[J].J Urol，1997，158（4）:1 403.

[4]Mizushima Y，Yanagawa A，Hoshi K.Prostaglandin E1 ismore effective，when incorporated in lipid microspheres，for treatment of peripheral vascular diseases inman[J].JPharm Pharmacol，1983，35（10）:666.

[5]Tobari S，Ikeda Y，Takami H.Beneficial effects of intravenous administration of lipo-prostaglandin E1 on the ischemic gastric tube in pigs[J].J Surg Res，2005，129（1）:79.

[6]Yamauchi K，Yasunaga S，Kawasaki H，et al.An approach to predict the ductusarteriosus dilating effect induced by lipo-prostaglandin E1 I newborn rats lacking plasma concentration-time data by the pharmacological response kineticmodel[J].Biol Pharm Bull，2003，26（2）:210.

[7]Yukiko K，Tetsuya A，Miki K，et al.Alteration of therapeutic efficacy of lipid microspheres incorporating prostaglandin E1 by mixing with aqueous solution[J].JPharmaceutical Science，2007，96（4）:935.

[8]Paul M，Razzouq N，Tixier G，et al.Stability of prostaglandin E1 in aqueous solutions[J].Eur JHosp Pharm Sci，2005，11（2）:31.

[9]Kurosaki Y，Hini B，Yamauchi K，et al.Drug delivery function of DDSs in clinical use:changes in phase-distribution of PGE1in lipid emulsions after dilution with aqueous infusions[J].Drug Deliv Syst，1998，13:441.

[10]Yamaguchi T，Tanabe N，F(xiàn)ukushima Y，et al.Distribution of prostaglandin E1 in lipid emulsion in relation to release rate fromLipid particles[J].Chem Pharm Bull，1994，42:646.

[11]尹翠娟，李顯林，高書文，等.紫外分光光度法測(cè)定注射用前列腺素E1 的含量[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2005，6（1）:11.

[12]關(guān)世俠，楊 民，王東凱.柱前衍生化高效液相色譜法測(cè)定前列地爾脂質(zhì)體的包封率[J].藥物分析雜志，2008，28（7）:1 162.