替加氟注射液無菌檢查方法學研究

王剛林，周 劍

（1.重慶醫療器械質量檢驗中心，重慶 401147；2.重慶市食品藥品檢驗所，重慶 401121）

替加氟為氟尿嘧啶的衍生物，能干擾、阻斷DNA和RNA、蛋白質合成，主要作用于S期，是細胞周期特異性藥物。其在體內經肝臟活化逐漸轉變為氟尿嘧啶而起抗腫瘤作用，作用機制、療效及抗瘤譜均與氟尿嘧啶相似，但作用持久、吸收良好、毒性較低，化療指數為氟尿嘧啶的2倍，毒性僅為氟尿嘧啶的1/7～1/4，臨床主要用于治療胃癌、直腸癌、胰腺癌、原發性肝癌、乳腺癌等。替加氟注射液全國現有19個生產批文，規格均為5 mL∶0.2 g。筆者選用其中6個廠家生產的替加氟注射液進行了無菌檢查方法學研究，現報道如下。

1 儀器與材料

KDGB330型一次性使用全封閉集菌器（杭州泰林生物技術設備有限公司）。替加氟注射液（廠家A，四川三精升和制藥有限公司，批號為 070502；廠家 B，齊魯制藥有限公司，批號為703002EU；廠家 C，陜西省秦光制藥廠，批號為 070211；廠家 D，天津金耀氨基酸有限公司，批號為608201；廠家E，山東魯抗辰欣藥業有限公司，批號為70107302；廠家F，哈藥集團生物工程有限公司，批號為 20070102。規格均為每支 5 mL∶0.2 g）。硫乙醇酸鹽流體培養基（批號為090118），改良馬丁培養基（批號為090706），營養肉湯培養基（批號為090322），均由中國藥品生物制品檢定所提供，經靈敏度試驗符合2010年版《中國藥典（二部）》規定[1]。試驗菌株為金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、生孢梭菌[CMCC（B）64941]、白色假絲酵母菌 [CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]，均由中國藥品生物制品檢定所提供。

2 方法與結果

2.1 菌液制備

接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，接種生孢梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中，于30～35℃培養24 h；接種白色假絲酵母菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中，于23～28℃培養48 h。上述5種培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數小于100 cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁培養基中，于23～28℃培養7 d，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL含孢子數小于100 cfu的孢子懸液。上述菌懸液每次試驗前均新鮮配制，備用。

2.2 需氧菌、厭氧菌檢查方法驗證試驗

根據文獻[2]試驗方法進行試驗。取單個濾筒12個，分成3組，每組4個，將規定量的供試品（陜西省秦光制藥廠，批號為070211，規格為 5 mL∶0.2 g）按每一濾筒中過濾 5支供試品，再用pH＝7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，1組濾筒不進行沖洗，另 2組每膜沖洗總量分別為 100 mL（分2次沖洗）、200 mL（分3次沖洗）。沖洗完畢后，將硫乙醇酸鹽培養基加至濾筒中，再在每一組濾筒中分別加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌4種試驗菌液各1mL。另取4個裝有同體積培養基的容器，分別加入4種試驗菌液1 mL，作為陽性對照。于適宜條件下培養2～7 d，逐日觀察記錄。結果見表1。可見，采用薄膜過濾法，每膜沖洗總量為100 mL并分2次沖洗，適用于本品的需氧菌、厭氧菌無菌檢查。

2.3 真菌檢查方法驗證試驗

抗腫瘤類藥物對真菌無抑菌作用，故采用規定量的供試品（陜西省秦光制藥廠，批號為 070211，規格為 5 mL∶0.2 g）對真菌檢查方法進行了考察。取單個濾筒2個，將規定量的供試品按每一濾筒中過濾5支供試品，不進行沖洗。完畢后，將改良馬丁培養基加至濾筒中，再在濾筒中分別加入黑曲霉、白色假絲酵母菌2種試驗菌液各1 mL。另取2個裝有同體積培養基的容器，分別加入2種試驗菌液1mL，作為陽性對照。于適宜條件下培養2～7 d，逐日觀察記錄。結果見表2。可見，采用薄膜過濾法，直接薄膜過濾而不沖洗，適用于本品的真菌無菌檢查。

2.4 方法確認

由于各個廠家的產品處方工藝均存在一定的差異，故采用6個廠家各1批樣品對2.2項和2.3項確定的方法進行了確認。結果見表3。可見，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌均于24h內生長良好，白色假絲酵母菌、黑曲霉均于72 h內生長良好。

3 討論

試驗結果表明，替加氟注射液對試驗菌中金黃色葡萄球菌的生長有一定抑制作用。參考文獻[3]，對其方法學進行研究，結果顯示，采用薄膜過濾法，用適量沖洗液沖洗，陽性對照菌選用金黃色葡萄球菌的方法是可行的。由此，建立的替加氟注射液無菌檢查方法為:將規定量樣品薄膜過濾后，真菌培養管和需氧菌、厭氧菌培養管及陽性對照管每膜采用不少于100 mL的沖洗液沖洗后，再加入適宜的培養基，以金黃色葡萄球菌作為陽性對照菌，依法進行無菌檢查。

表1 薄膜過濾法沖洗量考察結果

表2 薄膜過濾法沖洗量考察結果

注射劑作為藥品的一種重要劑型，被廣泛應用于臨床，由于其直接注入人體體內而發揮療效，因此其安全性顯得更為重要。現階段注射劑的質量越來越受到高度關注，而注射劑的滅菌是關系到藥品質量、保證用藥安全的重要工藝步驟之一，應選擇合適的滅菌方法，既能殺滅、除去微生物而達到滅菌的目的，又能保持藥物穩定。因此，無菌檢查是檢查滅菌效果的主要手段，也是注射劑質量控制的重要指標。

表3 各廠家產品試驗菌生長情況考察結果

本試驗中按照方法驗證的一般程序[2]，對替加氟注射液的無菌檢查法進行了系統研究。由于本品為氟尿嘧啶的衍生物，屬于抗腫瘤類藥物，對各試驗菌均無明顯抑菌作用，且各廠家產品處方工藝均存在一定的差異，故先選取處方較復雜的陜西省秦光制藥廠（處方為無水碳酸鈉、無水亞硫酸鈉、活性炭）的1批樣品進行試驗。試驗過程中發現，本品對金黃色葡萄球菌有較弱的抑制作用，而對其他試驗菌無抑菌作用。故選取金黃色葡萄球菌作為陽性敏感菌，并通過加大沖洗量的方法優化試驗條件。通過試驗，確定取規定量樣品、薄膜過濾后用0.1%蛋白胨緩沖液沖洗100 mL時，能夠很好地消除其抑菌作用。同時，用所建立的方法對其他5個廠家的5批樣品進行方法確認，結果均能達到檢查要求，最終確定該方法適合于替加氟注射液整個品種的無菌檢查。

參考文獻:

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[M].北京:化學工業出版社，2010:附錄Ⅺ H.

[2]錢文靜，張 玫.常見抗菌藥品無菌檢查中有關沖洗量的探討[J].江蘇藥學與臨床研究，2005，13（3）:63-65.

[3]姚 華，李秋菲，李惠娥，等.伊曲康唑注射液無菌檢查方法研究[J].中國藥業，2009，18（3）:20-21.