替加氟注射液無(wú)菌檢查方法學(xué)研究

王剛林，周 劍

（1.重慶醫(yī)療器械質(zhì)量檢驗(yàn)中心，重慶 401147；2.重慶市食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 401121）

替加氟為氟尿嘧啶的衍生物，能干擾、阻斷DNA和RNA、蛋白質(zhì)合成，主要作用于S期，是細(xì)胞周期特異性藥物。其在體內(nèi)經(jīng)肝臟活化逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榉蜞奏ざ鹂鼓[瘤作用，作用機(jī)制、療效及抗瘤譜均與氟尿嘧啶相似，但作用持久、吸收良好、毒性較低，化療指數(shù)為氟尿嘧啶的2倍，毒性僅為氟尿嘧啶的1/7～1/4，臨床主要用于治療胃癌、直腸癌、胰腺癌、原發(fā)性肝癌、乳腺癌等。替加氟注射液全國(guó)現(xiàn)有19個(gè)生產(chǎn)批文，規(guī)格均為5 mL∶0.2 g。筆者選用其中6個(gè)廠家生產(chǎn)的替加氟注射液進(jìn)行了無(wú)菌檢查方法學(xué)研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與材料

KDGB330型一次性使用全封閉集菌器（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司）。替加氟注射液（廠家A，四川三精升和制藥有限公司，批號(hào)為 070502；廠家 B，齊魯制藥有限公司，批號(hào)為703002EU；廠家 C，陜西省秦光制藥廠，批號(hào)為 070211；廠家 D，天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)為608201；廠家E，山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司，批號(hào)為70107302；廠家F，哈藥集團(tuán)生物工程有限公司，批號(hào)為 20070102。規(guī)格均為每支 5 mL∶0.2 g）。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（批號(hào)為090118），改良馬丁培養(yǎng)基（批號(hào)為090706），營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號(hào)為090322），均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，經(jīng)靈敏度試驗(yàn)符合2010年版《中國(guó)藥典（二部）》規(guī)定[1]。試驗(yàn)菌株為金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、生孢梭菌[CMCC（B）64941]、白色假絲酵母菌 [CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，于30～35℃培養(yǎng)24 h；接種白色假絲酵母菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，于23～28℃培養(yǎng)48 h。上述5種培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數(shù)小于100 cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，于23～28℃培養(yǎng)7 d，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1mL含孢子數(shù)小于100 cfu的孢子懸液。上述菌懸液每次試驗(yàn)前均新鮮配制，備用。

2.2 需氧菌、厭氧菌檢查方法驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)[2]試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)。取單個(gè)濾筒12個(gè)，分成3組，每組4個(gè)，將規(guī)定量的供試品（陜西省秦光制藥廠，批號(hào)為070211，規(guī)格為 5 mL∶0.2 g）按每一濾筒中過(guò)濾 5支供試品，再用pH＝7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，1組濾筒不進(jìn)行沖洗，另 2組每膜沖洗總量分別為 100 mL（分2次沖洗）、200 mL（分3次沖洗）。沖洗完畢后，將硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基加至濾筒中，再在每一組濾筒中分別加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌4種試驗(yàn)菌液各1mL。另取4個(gè)裝有同體積培養(yǎng)基的容器，分別加入4種試驗(yàn)菌液1 mL，作為陽(yáng)性對(duì)照。于適宜條件下培養(yǎng)2～7 d，逐日觀察記錄。結(jié)果見(jiàn)表1。可見(jiàn)，采用薄膜過(guò)濾法，每膜沖洗總量為100 mL并分2次沖洗，適用于本品的需氧菌、厭氧菌無(wú)菌檢查。

2.3 真菌檢查方法驗(yàn)證試驗(yàn)

抗腫瘤類(lèi)藥物對(duì)真菌無(wú)抑菌作用，故采用規(guī)定量的供試品（陜西省秦光制藥廠，批號(hào)為 070211，規(guī)格為 5 mL∶0.2 g）對(duì)真菌檢查方法進(jìn)行了考察。取單個(gè)濾筒2個(gè)，將規(guī)定量的供試品按每一濾筒中過(guò)濾5支供試品，不進(jìn)行沖洗。完畢后，將改良馬丁培養(yǎng)基加至濾筒中，再在濾筒中分別加入黑曲霉、白色假絲酵母菌2種試驗(yàn)菌液各1 mL。另取2個(gè)裝有同體積培養(yǎng)基的容器，分別加入2種試驗(yàn)菌液1mL，作為陽(yáng)性對(duì)照。于適宜條件下培養(yǎng)2～7 d，逐日觀察記錄。結(jié)果見(jiàn)表2。可見(jiàn)，采用薄膜過(guò)濾法，直接薄膜過(guò)濾而不沖洗，適用于本品的真菌無(wú)菌檢查。

2.4 方法確認(rèn)

由于各個(gè)廠家的產(chǎn)品處方工藝均存在一定的差異，故采用6個(gè)廠家各1批樣品對(duì)2.2項(xiàng)和2.3項(xiàng)確定的方法進(jìn)行了確認(rèn)。結(jié)果見(jiàn)表3。可見(jiàn)，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌均于24h內(nèi)生長(zhǎng)良好，白色假絲酵母菌、黑曲霉均于72 h內(nèi)生長(zhǎng)良好。

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，替加氟注射液對(duì)試驗(yàn)菌中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)有一定抑制作用。參考文獻(xiàn)[3]，對(duì)其方法學(xué)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，采用薄膜過(guò)濾法，用適量沖洗液沖洗，陽(yáng)性對(duì)照菌選用金黃色葡萄球菌的方法是可行的。由此，建立的替加氟注射液無(wú)菌檢查方法為:將規(guī)定量樣品薄膜過(guò)濾后，真菌培養(yǎng)管和需氧菌、厭氧菌培養(yǎng)管及陽(yáng)性對(duì)照管每膜采用不少于100 mL的沖洗液沖洗后，再加入適宜的培養(yǎng)基，以金黃色葡萄球菌作為陽(yáng)性對(duì)照菌，依法進(jìn)行無(wú)菌檢查。

表1 薄膜過(guò)濾法沖洗量考察結(jié)果

表2 薄膜過(guò)濾法沖洗量考察結(jié)果

注射劑作為藥品的一種重要?jiǎng)┬停粡V泛應(yīng)用于臨床，由于其直接注入人體體內(nèi)而發(fā)揮療效，因此其安全性顯得更為重要。現(xiàn)階段注射劑的質(zhì)量越來(lái)越受到高度關(guān)注，而注射劑的滅菌是關(guān)系到藥品質(zhì)量、保證用藥安全的重要工藝步驟之一，應(yīng)選擇合適的滅菌方法，既能殺滅、除去微生物而達(dá)到滅菌的目的，又能保持藥物穩(wěn)定。因此，無(wú)菌檢查是檢查滅菌效果的主要手段，也是注射劑質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。

表3 各廠家產(chǎn)品試驗(yàn)菌生長(zhǎng)情況考察結(jié)果

本試驗(yàn)中按照方法驗(yàn)證的一般程序[2]，對(duì)替加氟注射液的無(wú)菌檢查法進(jìn)行了系統(tǒng)研究。由于本品為氟尿嘧啶的衍生物，屬于抗腫瘤類(lèi)藥物，對(duì)各試驗(yàn)菌均無(wú)明顯抑菌作用，且各廠家產(chǎn)品處方工藝均存在一定的差異，故先選取處方較復(fù)雜的陜西省秦光制藥廠（處方為無(wú)水碳酸鈉、無(wú)水亞硫酸鈉、活性炭）的1批樣品進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，本品對(duì)金黃色葡萄球菌有較弱的抑制作用，而對(duì)其他試驗(yàn)菌無(wú)抑菌作用。故選取金黃色葡萄球菌作為陽(yáng)性敏感菌，并通過(guò)加大沖洗量的方法優(yōu)化試驗(yàn)條件。通過(guò)試驗(yàn)，確定取規(guī)定量樣品、薄膜過(guò)濾后用0.1%蛋白胨緩沖液沖洗100 mL時(shí)，能夠很好地消除其抑菌作用。同時(shí)，用所建立的方法對(duì)其他5個(gè)廠家的5批樣品進(jìn)行方法確認(rèn)，結(jié)果均能達(dá)到檢查要求，最終確定該方法適合于替加氟注射液整個(gè)品種的無(wú)菌檢查。

參考文獻(xiàn):

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（二部）[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:附錄Ⅺ H.

[2]錢(qián)文靜，張 玫.常見(jiàn)抗菌藥品無(wú)菌檢查中有關(guān)沖洗量的探討[J].江蘇藥學(xué)與臨床研究，2005，13（3）:63-65.

[3]姚 華，李秋菲，李惠娥，等.伊曲康唑注射液無(wú)菌檢查方法研究[J].中國(guó)藥業(yè)，2009，18（3）:20-21.