多指標正交試驗優選連芩軟膏的提取工藝

劉堅初 ，林 麗 ，強 姣 ，童國勇

（1.廣東省中山市黃圃人民醫院，廣東 中山 528429； 2.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510006）

連芩軟膏是黃圃人民醫院與廣州中醫藥大學新藥開發研究中心共同開發的新制劑，具有清熱解毒、消腫止痛、斂瘡生肌的功效，臨床主要用于各型痤瘡及痤瘡感染。組方中君藥黃連臨床用于癰腫瘡毒及皮膚濕瘡，也可制膏外用，常與黃芩、黃柏等配伍，現代藥理研究表明其具有抗菌、抗炎、鎮痛等作用，有效成分為鹽酸小檗堿[1-2]。鹽酸小檗堿易溶于乙醇[3]，為避免其在黃連煎煮、濃縮過程中的損失，大生產多采用滲漉法作為黃連中鹽酸小檗堿的最佳提取方式[4]。2010年版《中國藥典（一部）》收載的黃連成方制劑多采用醇提工藝，如隆清片、香附片、左金膠囊等。另外，臣藥黃芩的乙醇提取物也具有抗菌、抗炎、解熱鎮痛等作用[5]。為此，本研究中采用正交試驗法優選了連芩軟膏的乙醇滲漉提取工藝參數，旨在為制劑的研究開發奠定基礎。

1 儀器與試藥

島津LC-20A型高效液相色譜儀，包括ΜV檢測器、LC-20AT泵、SIL-20A自動進樣器、Labsolution色譜工作站；CP225D型萬分之一分析天平（Mettler Toledo）；AB2004-N型十萬分之一分析天平（Mettler Toledo）。黃芩苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110715-201016）；鹽酸小檗堿對照品（上海融禾醫藥科技有限公司，批號為110322）；色譜甲醇購自Merck公司，水為自制超純水，其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 黃芩苷及鹽酸小檗堿的含量測定

2.1.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱:Kromasil C18柱（250mm ×4.6mm，5 μm）；流動相:甲醇（A）-0.1% 磷酸溶液（B），梯度洗脫，0～20 min 時 40%A，20～30 min時 40% ～50%A，30～40 min時50%A，40～45 min時 55% ～40%A，45～50 min時 40%A；流速:1.0 mL /min；檢測波長:黃芩苷280 nm，鹽酸小檗堿345 nm；柱溫:30℃；進樣量:10μL。在此色譜條件下，供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上有相同保留時間的色譜峰，陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.2 溶液制備

稱取黃芩苷對照品 2.44 mg、鹽酸小檗堿對照品4.94 mg，精密稱定，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為對照品貯備液；精密量取黃芩苷貯備液和鹽酸小檗堿貯備液各1.0mL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液（含黃芩苷 0.0244 g/L、鹽酸小檗堿 0.049 g /L）。按處方比例稱取全方藥材，粉碎成粗粉，裝入滲漉裝置，少量70%乙醇浸潤24 h后，用10倍量的70%乙醇進行滲漉，滲漉速率為6mL/（min·kg），收集滲漉液，置500 mL容量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品原液；精密量取供試品原液1.0 mL，置10mL容量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。按處方比例稱取除黃芩外的全方藥材，或除黃連、黃柏和黃藤外的全方藥材，分別按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.1.3 標準曲線繪制

按2.1.1項下色譜條件，分別精密吸取混合對照品溶液0，2，4，8，12，16，20 μL，注入色譜儀測定，以峰面積積分值為縱坐標（Y）、對照品進樣質量（μg）為橫坐標（X）繪制標準曲線，回歸方程黃芩苷為 Y＝3 323 939.496 5X+1 558.846 4（r＝ 1.000 0）；鹽酸小檗堿為 Y＝3 563 917.535 7X-3 261.402 7（r＝1.000 0）。結果表明，黃芩苷與鹽酸小檗堿的進樣質量分別在0.204 8～2.048 0μg和 0.216 0～2.160μg范圍內與峰面積積分值線性關系良好。另外，本研究中所建立的含量測定方法已于前期進行了方法學考察，結果表明，該方法合理、可行。

2.2 浸膏得率的測定

精密量取供試品原液100mL，置已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，于105℃干燥至恒重，精密稱定，計算浸膏得率。

2.3 正交試驗

正交試驗設計:在確定乙醇滲漉工藝路線基礎上，根據預試驗結果，選取乙醇濃度（因素A）、溶劑用量（因素 B）、藥材粉碎粒度（因素 C）及滲漉速率（因素D）為考察因素，因素水平見表1。

表1 因素水平表

正交優選試驗:按照正交試驗設計進行試驗，提取效果以君藥黃連、臣藥黃芩中有效成分鹽酸小檗堿、黃芩苷的提取率(指標Ⅰ，指標Ⅱ)和組方的浸膏得率(指標Ⅲ)為指標，提取率（%）＝黃芩苷得率/藥材中黃芩苷含量×100%。并按照鹽酸小檗堿0.42、黃芩苷0.18、浸膏得率0.4的權重系數對其進行加權評分，分別填于正交設計軟件，進行直觀分析。方差分析，結果見表2及表3。

表2 L9（34）正交試驗結果

表3 方差分析結果

結果分析:由表2中 R值可知，乙醇濃度、粉碎粒度是影響滲漉工藝提取效果的主要因素，溶劑用量、滲漉速率次之。方差分析（表3）結果顯示，因素A及C對滲漉工藝中鹽酸小檗堿、黃芩苷的提取率和浸膏得率的影響有顯著性。結合極差分析結果及低耗高效原則，確定連芩軟膏最佳滲漉工藝條件為A2B3C2D3，即處方藥材粉碎成粗粉，加12倍量70%乙醇進行滲漉，滲漉速率為 9 mL /（min·kg）。

2.4 工藝驗證試驗

按最佳滲漉工藝條件A2B3C2D3進行重復試驗，結果見表4。可見，該工藝合理，穩定可行。

3 討論

鹽酸小檗堿及黃芩苷的抗炎、抗菌藥效作用提示，本制劑滲漉工藝正交試驗選取君藥黃連中鹽酸小檗堿及臣藥中黃芩苷的提取率作為考察指標之一，具有合理性。另外，本試驗過程中發現，組方中除去君藥黃連外，黃柏、黃藤同樣含有鹽酸小檗堿（以鹽酸小檗堿計，黃連中含量為6.08%，黃柏中含量為3.55%，黃藤中含量為2.54%）。為避免試驗差錯，故制備了缺黃連、黃柏、黃藤的陰性樣品考察鹽酸小檗堿的專屬性，同時將黃柏、黃藤藥材也作為綜合評分的權重系數之一。因此，本試驗中給予鹽酸小檗堿及黃芩苷權重系數分別為0.42和0.18，以及浸膏得率的權重系數為0.4，進行綜合評分。若能加之藥理試驗，對正交試驗進行評價，則所優選工藝更顯合理性。

表4 最佳工藝條件驗證試驗

參考文獻:

[1]余園媛，王伯初，彭 亮，等.黃連的藥理研究進展[J].重慶大學學報，2006，29（2）:107-108.

[2]李 娜，陳琴華.黃連-小檗堿的藥理作用研究概況[J].中國臨床醫藥研究雜志，2006（159）:28-29.

[3]羅音久，曾中良，古淑英，等.黃連須中鹽酸小檗堿的提取工藝研究[J].四川畜牧獸醫學院學報，2002，16（3）:17-18.

[4]芩志芳，郭淑英.用正交設計法優化黃連的提取工藝研究[J].中國民族民間醫藥，2009(12):17-18.

[5]劉菊福，盧長安，廖福龍，等.不同產地黃芩提取物主要藥效作用的比較[J].中國中醫藥信息雜志，2001，8（3）:28.