淫羊藿油炙前后及分別組成二仙湯后對腎陽虛小鼠溫腎助陽作用比較研究

熊 瑞，胡昌江，趙 玲，耿媛媛，潘 新

(成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 611137)

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淫羊藿油炙前后及分別組成二仙湯后對腎陽虛小鼠溫腎助陽作用比較研究

熊 瑞，胡昌江*，趙 玲，耿媛媛，潘 新

(成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 611137)

目的：比較淫羊藿油炙前后及分別組成二仙湯后對腎陽虛小鼠臟器指數(shù)、自主活動變化和血清睪酮的影響，探討生、炙淫羊藿溫腎助陽作用的差異。方法：采用氫化可的松所致的腎陽虛小鼠模型，比較淫羊藿油炙前后及分別組成二仙湯后對小鼠臟器指數(shù)(睪丸、精囊腺、包皮腺、胸腺)、自主活動變化及血清睪酮變化的影響，分析油炙前后淫羊藿溫腎助陽功效的差異。結(jié)果：與模型組相比，淫羊藿生品、炙品及二仙湯生品、炙品均具有極顯著升高血清睪酮的作用(P<0.01)，且炙品升高效果顯著強(qiáng)于生品(P<0.05)；除模型組外，各組小鼠臟器指數(shù)(睪丸、胸腺、包皮腺和精囊腺)和自主活動性均有顯著改善(P<0.05～0.01)。結(jié)論：淫羊藿油炙前后及分別組成二仙湯后對氫化可的松所致腎陽虛小鼠臟器指數(shù)、血清睪酮和自主活動變化均具有較明顯改善作用，且淫羊藿油炙后溫腎助陽作用強(qiáng)于生品。

淫羊藿；油炙；腎陽虛；臟器指數(shù)；血清睪酮

淫羊藿的本草文獻(xiàn)初見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，關(guān)于淫羊藿的炮制方法最早見于《雷公炮炙論》：“凡使(時呼仙靈脾)，需用夾刀去葉、四畔花(枝)盡后，細(xì)銼，用羊脂相對拌炒過，待羊脂四兩為度也[1]”。此法在歷代資料中均有記載，且1977-2010版《中華人民共和國藥典》(后簡稱《中國藥典》)均只記載此法。淫羊藿生品性辛、甘、溫，歸肝、腎經(jīng)，因羊脂油甘溫，能溫散寒邪、補(bǔ)腎助陽，故油炙后能增強(qiáng)其溫腎助陽的作用。中醫(yī)臨床常將其與仙茅、當(dāng)歸、巴戟天、黃柏和知母組成二仙湯，具有溫腎陽、補(bǔ)腎精、瀉腎火和調(diào)理沖任的功效。本實驗通過比較淫羊藿油炙前后對氫化可的松所致腎陽虛小鼠模型溫腎壯陽作用的差異，擬從臟器指數(shù)、自主活動性、自主站立性和血清睪酮含量改變等方面進(jìn)行比較研究，初步探討油炙對淫羊藿溫腎助陽作用的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

昆明種小鼠，雄性，體重18～22g，普通級，由成都達(dá)碩實驗動物有限公司提供(實驗動物生產(chǎn)合格證號：SCXK(川)2008-24)。小鼠于成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理三級科研實驗室中飼養(yǎng)(許可證號：川實動管第015號)，國家中醫(yī)藥管理局三級實驗室中觀察(NO.TCM-2009-324)。

1.2 藥物與試劑

淫羊藿、黃柏、知母、仙茅、巴戟、當(dāng)歸均購自荷花池中藥材市場，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室盧先明教授鑒定為真品，均為2010版《中國藥典》收載品種。實驗室前期分別對已購得的淫羊藿EpimediumbrevicornuMaxim和箭葉淫羊藿Epimediumsagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim進(jìn)行入藥標(biāo)準(zhǔn)的考察，結(jié)果表明淫羊藿在總黃酮含量、淫羊藿苷含量、醇浸出物等指標(biāo)方面均高于箭葉淫羊藿，且已有文獻(xiàn)報道[4]淫羊藿化學(xué)成分較穩(wěn)定，箭葉淫羊藿種內(nèi)質(zhì)量差異較大，故本實驗選擇淫羊藿作為實驗藥物。

油炙淫羊藿采用課題組前期研究的最佳工藝：溫度160℃，時間為7min(每100kg淫羊藿消耗羊脂油煉油20kg)[3]。藥液制備：取淫羊藿生品和炙品并分別組成二仙湯，加12倍水浸泡0.5h，煎煮1h，過濾，濾渣再加12倍量水，煎煮2次，每次1h，過濾，合并藥液，減壓濃縮至相應(yīng)濃度。

氫化可的松(規(guī)格5mg·mL-1)：太極西南藥業(yè)股份有限公司，批號121103；氯化鈉注射液(0.9%)：四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號M12120821；金匱腎氣丸：北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，批號1030582；小鼠睪酮(T)酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒(96T)：上海尚樂生物科技有限公司，批號201306。

1.3 儀器

ZZ-6小鼠自主活動測試儀(成都泰盟科技有限公司)；LT502型電子天平(常熟市天量儀器有限責(zé)任公司)；AR862A型紅外測溫儀(希瑪SMART SENSOR)；離心機(jī)(上海安婷科學(xué)儀器廠)；酶標(biāo)儀(芬蘭 Labsystems Multiskan MS，型號：352型)；洗板機(jī)(芬蘭Thermo Labsystems，型號：AC8型)；離心機(jī)(國產(chǎn)微量高速離心機(jī)，型號：TG16W 型)；培養(yǎng)箱(國產(chǎn)隔水式恒溫培養(yǎng)箱，型號：GNP-9080型)。

1.4 實驗方法

1.4.1 造模方法 取健康雄性KM小鼠若干，正常組小鼠(13只)每天按0.1mL/20g劑量注射等體積NaCl注射液，其余造模動物每天于皮下注射氫化可的松注射液(25mg·kg-1)，連續(xù)注射7天，停藥6天。動物在造模期間出現(xiàn)死亡，且造模動物出現(xiàn)活動減少、反應(yīng)遲鈍、弓背蜷縮、體毛稀疏、無光澤、飲食飲水量減少等現(xiàn)象，說明造模成功[5]。

1.4.2 分組 取符合上述表現(xiàn)的造模小鼠若干，隨機(jī)分為14組：模型組、金匱腎氣丸組(5g·kg-1)，生品低、中、高劑量組(6g·kg-1，12g·kg-1，24g·kg-1)，炙品低、中、高劑量組(6g·kg-1，12g·kg-1，24g·kg-1)，二仙湯生品低劑量組(8g·kg-1，16g·kg-1，32g·kg-1)，二仙湯炙品低劑量組(8g·kg-1，16g·kg-1，32g·kg-1)，每組13只。

1.4.3 給藥方法 第14天開始，正常對照組和模型對照組小鼠每日按0.2mL/10g劑量灌胃純凈水，其余各組小鼠每日均等體積灌胃給藥，連續(xù)給藥14天。

1.4.4 血清睪酮及臟器指數(shù)測定方法 于第28天末次給藥1h后，用眼眶取血法采集各組小鼠血液，分離血清(3 000rpm，10min)，-20℃保存待測，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定血清睪酮含量。小鼠取血后處死，精確剝?nèi)⌒∈蟛G丸、精囊、包皮腺和胸腺，精確稱濕重。

1.4.5 自主活動性和自主站立性測定方法 從造模開始，每30天稱1次體重，稱重后，于造模前、造模后與給藥后分別采用自主活動儀測定10min內(nèi)小鼠自發(fā)自主活動次數(shù)和自主站立次數(shù)。將小鼠放入自主活動儀內(nèi)，前3min為適應(yīng)期，后10min由計數(shù)儀統(tǒng)計小鼠自主活動次數(shù)。觀察指標(biāo)為其自主活動性和自主站立性的變化情況。

自主活動數(shù)變化=(藥后活動數(shù)-藥前活動數(shù))/藥前活動數(shù)；

自主站立數(shù)變化=(藥后站立數(shù)-藥前站立數(shù))/藥前站立數(shù)；

臟器指數(shù)=臟器重量絕對值(g)/小鼠重量(g)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 對血清睪酮的影響

與模型組相比，淫羊藿生、炙品組及二仙湯生、炙品各劑量組小鼠血清睪酮含量均極顯著性升高(P<0.01)；與等劑量淫羊藿生品組相比，中、高劑量淫羊藿炙品組小鼠血清睪酮含量顯著升高(P<0.05)；與等劑量二仙湯生品組相比，中、高劑量二仙湯炙品組小鼠血清睪酮含量顯著升高(P<0.05)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明，淫羊藿生、炙品無論是單味使用還是納入二仙湯，均對腎陽虛造成的血清睪酮下降有顯著改善作用，且炙品的作用明顯強(qiáng)于生品，結(jié)果見表1。

2.2 對臟器指數(shù)的影響

與正常對照組比較，其余各組小鼠睪丸、胸腺及包皮腺指數(shù)顯著降低(P<0.05)。睪丸指數(shù)：與模型組相比，淫羊藿炙品高劑量組、二仙湯生品生品高劑量及二仙湯炙品高劑量組小鼠睪丸指數(shù)顯著升高(P<0.05～0.01)；精囊腺指數(shù)：與模型組相比，二仙湯生品及炙品高劑量組小鼠精囊腺指數(shù)顯著升高(P<0.05)；胸腺指數(shù)：與模型組相比，二仙湯炙品高劑量組小鼠胸腺指數(shù)顯著升高(P<0.05)；包皮腺指數(shù)：與模型組相比，淫羊藿生品高劑量、淫羊藿炙品高劑量及二仙湯炙品高劑量小鼠包皮腺指數(shù)顯著升高(P<0.05)。結(jié)果提示，用氫化可的松復(fù)制腎陽虛模型，可致小鼠睪丸、胸腺及包皮腺指數(shù)明顯降低，且淫羊藿油炙前后及組成二仙湯后在到達(dá)一定劑量時可明顯改善小鼠臟器指數(shù)，生品與炙品淫羊藿的溫腎助陽功效差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但部分指數(shù)可見淫羊藿炙品改善效果更顯著，可認(rèn)為炙淫羊藿有優(yōu)于生品的趨勢，結(jié)果見表2。

2.3 對自主活動性和自主站立性的影響

自主活動性：與模型組相比，炙品低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠自主活動性顯著提高(P<0.05～0.01)，生品中劑量組、高劑量組小鼠極顯著提高(P<0.01)；炙品與生品在改善小鼠自主活動性和自主站立性方面無統(tǒng)計學(xué)差異，但炙品起效劑量降低，在低劑量時已開始表現(xiàn)出差異，說明炙品作用有強(qiáng)于生品的趨勢；與模型組相比，二仙湯生品組、炙品組各劑量組小鼠自主活動性和自主站立性均有極顯著提高(P<0.01)，但二仙湯生品組和炙品組無統(tǒng)計學(xué)差異。

表1 生、炙淫羊藿及納入二仙湯對血清睪酮含量影響 (±s)

注：模型組與正常對照組比較，**P<0.01；各給藥組與模型組比較，##P<0.01。

表2 對臟器指數(shù)的影響 (±s,×10-3)

注：模型組與正常對照組比較，*P<0.05；各給藥組與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

自主站立性：與模型組相比，生、炙品中、低劑量均能在一定程度上提高小鼠自主站立性(P>0.05)，炙品高劑量組小鼠自主站立性顯著提高(P<0.05)，雖然生、炙品在提高自主活動性和自主站立性方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但唯有炙品高劑量組出現(xiàn)顯著差異，未在生品中有所體現(xiàn)，因此在一定程度上說明炙品作用有強(qiáng)于生品的趨勢；與模型組相比，二仙湯生品、炙品中、低劑量均能在一定程度上提高小鼠自主站立性(P>0.05)，二仙湯生、炙品高劑量組小鼠自主活動性均有顯著性提高(P<0.05)，二仙湯生、炙品在提高小鼠自主活動性和自主站立性方面無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果見表3。

表3 對自主活動性的影響 (±s)

注：各給藥組與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3 討論

實驗結(jié)果表明，淫羊藿油炙前后及分別組成二仙湯后均對氫化可的松所致腎陽虛小鼠血清睪酮含量下降有顯著的改善作用，且油炙品作用明顯強(qiáng)于生品；對氫化可的松致小鼠腎陽虛模型的臟器指數(shù)(睪丸、包皮腺、胸腺和精囊腺)均有明顯改善，但油炙品作用有強(qiáng)于生品的趨勢；對腎陽虛模型小鼠自主活動性和自主站立性亦有明顯改善，油炙品的作用有強(qiáng)于生品的趨勢。

綜上所述，炙淫羊藿的溫腎助陽作用優(yōu)于生品淫羊藿，且生、炙淫羊藿均有溫腎助陽的功效，這與《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]上所述“味辛、寒”有一定的出入，與淫羊藿油炙后增強(qiáng)溫腎陽作用的傳統(tǒng)認(rèn)識一致，可為臨床合理選用淫羊藿炮制品提供一定的依據(jù)。

[1] 雷敩.雷公炮炙論[M].南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,1985:97.

[2] 清·顧光重輯.神農(nóng)本草經(jīng)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1955.

[3] 周一帆,胡昌江,余凌英,等.星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選淫羊藿油炙工藝[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2012,18(16):16-18.

[4] 郭寶林,肖培根.中藥淫羊藿主要種類評述[J].中國中藥雜志,2003,28(4):303-307.

[5] 劉俊達(dá).韭菜子鹽炙前后溫補(bǔ)腎陽的機(jī)理研究[D].成都:成都中醫(yī)藥大學(xué),2011.

[6] 李寅超,黃蘭嵐,趙宜紅,等.不同煉制溫度和用量的羊脂油制淫羊藿對腎陽虛大鼠的影響[J].中國中藥雜志,2011,36(16):2250-2254.

[7] 牛銳.淫羊藿炮制前后對小鼠血漿睪酮及附性器官的影響[J].中國中藥雜志,1989,14(9):18.

[8] 劉俊達(dá).韭菜子鹽炙前后溫補(bǔ)腎陽的機(jī)理研究[D].成都:成都中醫(yī)藥大學(xué),2011.

[9] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].第1部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010.

(責(zé)任編輯：尹晨茹)

Comparative Study on the Effect of the Crude and Mutton-Fat-Processed Epimedii Folium in Er’xian Decoction on Nourishing and Warming Kidney-yang

Xiong Rui, Hu Changjiang*, Zhao Ling, Geng Yuanyuan, Pan Xin

(College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 611137,China)

Objective:To compare the effect of the crude Epimedii folium, mutton-fat-processed Epimedii folium and Er’xian Decoction (EXD) containing the two respectively on organ coefficient, locomotor activity and Serum testosterone, for discussing the difference of the crude and the mutton-fat-processed. Methods:To adopt murine model of kidney-yang asthenia caused by hydrocortisone and analyze the distinction of the crude and the mutton-fat-processed through comparing organ coefficient (testis, seminal vesicle, preputial glands and thymus), locomotor activity and the level of serum testosterone(ST). Results:Compared with normal control group, the level of ST significantly increased in the crude, mutton-fat-processed and EXD containing the two respectively (P<0.01), and the mutton-fat-processed are more effective than the crude. Organ coefficient (testis, seminal vesicle, preputial glands and thymus) and locomotor activity were significant improved(P<0.05～0.01).Conclusion:The crude, mutton-fat-processed Epimedii folium and EXD containing the two respectively can improve organ coefficient, locomotor activity and the level of ST, moreover, the mutton-fat-processed is better.

Epimedii Folium; Mutton-Fat-Processed; Nourishing and Warming Kidney-yang; Organ Coefficient; Serum Testosterone

2014-07-10

中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(20110700717)

熊瑞(1991-)，女，成都中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，研究方向為中藥炮制學(xué)。

作者簡介：胡昌江(1952-)，男，成都中醫(yī)藥大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為中藥炮制學(xué)教學(xué)及科研。

R285.5

A

1673-2197(2014)22-0005-03