川芎配方顆粒提取工藝及咖啡酸、阿魏酸含量測定

羅 旭，胡昌江，吳文輝，王 虎，馮 健

(四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司，四川 成都 611930)

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川芎配方顆粒提取工藝及咖啡酸、阿魏酸含量測定

羅 旭，胡昌江*，吳文輝，王 虎，馮 健

(四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司，四川 成都 611930)

目的：優(yōu)選川芎配方顆粒提取工藝,建立咖啡酸和阿魏酸含量的測定方法。方法：以正交試驗優(yōu)選川芎配方顆粒的提取工藝，采用HPLC建立其咖啡酸、阿魏酸含量測定方法。結(jié)果：優(yōu)選出川芎配方顆粒提取工藝為10倍量水, 浸泡0.5h, 每次1h，提取3次；咖啡酸和阿魏酸HPLC測定方法為：流動相：乙腈-0.1%磷酸(14∶86)；檢測波長：323nm；流速：1.0mL/min，理論板數(shù)按阿魏酸峰計算應(yīng)不低于4 000。結(jié)論：該提取工藝有效成分提取效率高，質(zhì)量控制方法穩(wěn)定可行, 可作為川芎配方顆粒生產(chǎn)和質(zhì)量控制的科學(xué)依據(jù)。

川芎配方顆粒；咖啡酸；阿魏酸；含量測定

川芎為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖[1]，辛、溫、歸肝、膽、心包經(jīng)，活血行氣、祛風(fēng)止痛，用于治療胸痹心痛、胸脅刺痛、跌撲腫痛、月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)、癥瘕腹痛、頭痛、風(fēng)濕痹痛等。川芎主要含揮發(fā)油、生物堿、有機酚酸及酯類、多糖類等多種化學(xué)成分[2-4]。其中揮發(fā)油和有機酚酸及酯類是其主要的有效成分，具有擴張血管、降血壓、抗心肌缺血、抗腦缺血、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等多種藥理作用[5-7]。川芎飲片臨床煎煮均要求后下以保證療效，而川芎配方顆粒是在飲片煎煮的原則指導(dǎo)下，經(jīng)現(xiàn)代制藥工藝提取、濃縮、干燥、制粒而成的單味顆粒劑。故川芎配方顆粒的現(xiàn)代提取工藝和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和方法亟待建立。本實驗以咖啡酸、阿魏酸的含量并結(jié)合干浸膏得率作為主要考察指標(biāo)，優(yōu)選出川芎配方顆粒的最佳提取工藝條件，為川芎配方顆粒的生產(chǎn)工藝提供依據(jù)，并初步建立川芎配方顆粒的咖啡酸、阿魏酸含量測定方法，為其質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

美國Waters2695-2996高效液相色譜儀,Empower色譜工作站；電子天平：BP211D電子天平(d=0.1mg/0.01mg,max=210g/80g，Sautoris，德國)；KQ5200DB型超聲波清洗器(昆山市儀器有限公司),咖啡酸對照品( 批號：110885-200102，中國食品藥品檢定研究院)；阿魏酸對照品(批號：110773-200611；中國食品藥品檢定研究院)；色譜級甲醇、乙腈(迪馬公司)；水為重蒸水，其它試劑均為分析純。川芎和川芎配方顆粒均由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司提供(批號：1303102、1302090、1304306、1312091、1312092、1312093)。

2 方法與結(jié)果

2.1 咖啡酸、阿魏酸含量測定方法建立

2.1.1 檢測波長選擇 實驗分別對咖啡酸、阿魏酸對照品溶液在200～400nm波長進行掃描，均在323nm處咖啡酸、阿魏酸有最大吸收且靈敏度最高，因此確定咖啡酸、阿魏酸的檢測波長為323nm。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取咖啡酸、阿魏酸對照品適量，加70%甲醇制成每1mL含咖啡酸20μg、含阿魏酸30μg的混合溶液，即得。

2.1.3 提取溶劑考察 取本品顆粒(批號1312091)4份，每份0.5g,研細(xì)，精密稱定，置100mL錐形瓶中，分別精密加入不同溶劑甲醇、70%甲醇、乙醇、70%乙醇25mL，稱重，加熱回流30min，取出，放冷，再次稱定重量，用相應(yīng)溶劑補足減失重量，濾過，取續(xù)濾液進樣。測定咖啡酸、阿魏酸總含量。見表1。

表1 不同溶劑考察結(jié)果 (n=2)

結(jié)果表明，提取溶劑為70%甲醇的咖啡酸、阿魏酸總含量最高，且雜質(zhì)峰少無干擾，因此確定提取溶劑為70%甲醇。

2.1.4 提取方法考察 取本品顆粒(批號1312091)2份，每份0.5g,研細(xì)，精密稱定，置100mL錐形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，稱重，分別超聲(功率200W，頻率25kHz)和回流30min，取出，放冷，再次稱定重量，用甲醇補足減失重量，濾過，取續(xù)濾液進樣。測定超聲、回流所得咖啡酸、阿魏酸總含量分別為1.38、 1.45mg/g，結(jié)果表明，回流提取比超聲提取總含量更高，所以確定提取方法為回流提取法。

2.1.5 提取時間考察 取本品顆粒(批號080601)4份，每份0.5g,研細(xì)，精密稱定，置100mL錐形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，稱重，分別加熱回流10、20、30、40min，取出，放冷，再次稱定重量，用70%甲醇補足減失重量，濾過，取續(xù)濾液進樣。測定10、20、30、40min提取時間下咖啡酸、阿魏酸總含量分別為1.37、1.42、 1.46、1.46mg/g，故確定回流提取時間為30min。

從以上可知，確定供試品制備方法：取本品顆粒0.5g，研細(xì)，精密稱定，置100mL錐形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，稱重，加熱回流30min，取出，放冷，再次稱定重量，用70%甲醇補足減失重量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.6 陰性樣品溶液制備 取本品缺川芎的陰性樣品0.5g，照供試品的制備方法制成陰性樣品溶液。

2.1.7 色譜條件 色譜柱： DiamonsiL ODS-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：乙腈-0.1%磷酸(14∶86)；檢測波長：323nm；流速：1.0mL/min，理論板數(shù)按阿魏酸峰計算應(yīng)不低于4 000。

在此條件下，川芎配方顆粒中咖啡酸、阿魏酸的分離度好，理論塔板數(shù)較高，峰形對稱性好。結(jié)果見圖1。

圖1 川芎配方顆粒HPLC圖譜

2.1.8 方法學(xué)考察

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別精密吸取上述咖啡酸、阿魏酸混合對照品溶液(咖啡酸0.0276mg/mL、阿魏酸0.0392mg/mL)1.0、2.0、5.0、10.0、20.0μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以咖啡酸、阿魏酸的峰面積值(Y)為縱坐標(biāo)，以咖啡酸、阿魏酸的進樣量(X)為橫坐標(biāo)，計算得咖啡酸回歸方程為Y=5×106X -34640, r2= 0.999 2，阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=5×106X -64562，r2=0.999 3，咖啡酸在0.0276～0.552μg范圍內(nèi)，阿魏酸在0.0392～0.784μg范圍內(nèi)，對照品峰面積與進樣量有良好的線性關(guān)系。

(2)精密度試驗。精密吸取上述對照品溶液10μL，連續(xù)進樣6次，測定峰面積。計算得RSD%為0.96(n=6)，結(jié)果表明儀器精密度良好。

(3)重復(fù)性試驗。稱取同一批樣品(批號1312091)，精密稱定，按上述測定方法制備樣品供試品溶液，共6份，測定峰面積，RSD%為0.79(n=6)，結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性良好。

(4)穩(wěn)定性試驗。精密吸取上述對照品溶液和供試品溶液各10μL, 置室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、10h進樣，按上述色譜條件測定咖啡酸、阿魏酸的峰面積，計算得對照品RSD%為0.72 (n=6)，供試品RSD% 為1.04 (n=6)，結(jié)果表明對照品溶液和供試品溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

(5)加樣回收試驗。取已知含量的樣品(批號1312091,咖啡酸含量為0.501mg/g，阿魏酸為1.01mg/g)0.25g，精密稱定，共6份，分別精密加入咖啡酸、阿魏酸適量對照品溶液，按正文供試品溶液制備方法和色譜條件，制備加樣回收供試品溶液，注入液相色譜儀，測定，計算回收率。咖啡酸平均回收率為99.44%，RSD為1.90%，阿魏酸平均回收率為99.03%，RSD為2.13%，樣品加樣回收率在95%～105%之間。表明樣品回收率良好。結(jié)果見表2、表3。

表2 咖啡酸回收率試驗結(jié)果

表3 阿魏酸回收率試驗結(jié)果

(6)樣品測定。分別取不同批號的川芎配方顆粒約0.5g，精密稱定，按上述方法制備供試品溶液，分別進樣10μL，按上述色譜條件測定咖啡酸、阿魏酸峰面積，計算咖啡酸、阿魏酸總含量，分別為1.33、1.28、1.41、1.35 、1.26、1.37 mg/g,6批川芎配方顆粒中每1g咖啡酸、阿魏酸的總含量為1.26mg～1.41mg，故暫定本品每1g配方顆粒含咖啡酸(C9H8O4)、阿魏酸(C21H18O12)總量不得少于1.0mg。

2.2 川芎配方顆粒劑提取制備工藝條件篩選

2.2.1 正交試驗 傳統(tǒng)中藥湯劑多用水煎煮, 目前國內(nèi)已生產(chǎn)的配方顆粒的提取溶劑均為水, 因此本文選用水作為提取溶劑。根據(jù)影響的因素，固定浸泡的時間為0.5h,選擇加水量、提取時間、提取次數(shù)為考察因素。以咖啡酸、阿魏酸含量和總出膏率為主要考察指標(biāo), 對川芎配方顆粒劑的提取工藝進行正交試驗, L9(34)正交試驗安排見表4，以下部分的HPLC法測定各工藝下干膏率和制得浸膏中咖啡酸、阿魏酸含量, 結(jié)果見表5。

綜合評分的計算方法為：以得率最大者為100%，將其它組別結(jié)果換算為最高值的百分比，再以咖啡酸、阿魏酸、出膏率含量權(quán)重分別占35%、35%、30%的比例進行相加后所得的值。

表4 因素水平表

表5 正交試驗

表6 方差分析結(jié)果

對表5直觀分析表明,各影響效果依次為C>A>B；因此因素C(提取次數(shù))有顯著性影響。加水量和提取時間影響不明顯。經(jīng)表5、表6分析得出的最佳提取工藝條件為A3B2C3,即加12倍量水，浸泡0.5h，每次1h,提取3次。從大生產(chǎn)節(jié)約成本因素考慮，優(yōu)化工藝方案為A2B2C3,即加10倍量水，浸泡0.5h，每次1h，提取3次。

2.2.2 實驗驗證 為確定工藝的優(yōu)劣和穩(wěn)定性，以A2B2C3組合進行了3批驗證試驗，試驗證明，3批該工藝下的綜合評分達(dá)到96%以上，證明該工藝穩(wěn)定可靠，合理可行。

2.3 配方顆粒制備

按上述確定的工藝提取川芎飲片,合并煎液，濃縮和干燥制成干浸膏粉, 粉碎,加入適量輔料, 混勻,制粒,整粒，即得川芎配方顆粒。

分別取不同批號的川芎配方顆粒約0.5g，精密稱定，按上述方法制備供試品溶液，分別進樣10μL，按上述色譜條件測定咖啡酸、阿魏酸峰面積，計算咖啡酸、阿魏酸總含量，分別為1.33、1.28、1.41、1.35、1.26、1.37mg/g,6批川芎配方顆粒中每1g咖啡酸、阿魏酸的總含量為1.26mg～1.41mg，故暫定本品每1g配方顆粒含咖啡酸(C9H8O4)和阿魏酸(C21H18O12)總量不得少于1.0mg。

3 討論

川芎配方顆粒的水提工藝直接關(guān)系到配方顆粒的質(zhì)量，以總干膏量和咖啡酸、阿魏酸的含量作為衡量指標(biāo), 初步評價工藝的提取效果。提取工藝研究表明, 煎煮時間和加水量對工藝的影響較小，為次要因素, 而煎煮次數(shù)對咖啡酸、阿魏酸的含量和出膏率有顯著的影響, 是該飲片提取工藝的重要因素。綜合分析比較最終確定提取工藝為加10倍量水、浸泡0.5h、煎煮1h、提取3次,再次驗證表明工藝及結(jié)果合理比較穩(wěn)定。

由于川芎飲片中含有揮發(fā)油成分，但在煎煮過程中損失掉了。為了保持與傳統(tǒng)中藥湯劑煎煮一致的原則，故未采取單獨提取揮發(fā)油再加入到顆粒中的方法。

該實驗用《中國藥典》2010年版一部川芎藥材的流動相甲醇-1%冰醋酸(70∶30)，經(jīng)證明阿魏酸的分離度好，對稱性高，保留時間適中，而咖啡酸對稱性不好,且基線高，易出現(xiàn)拖尾，達(dá)不到分離要求，綜合考慮阿魏酸和咖啡酸，故未采用藥典2010年版的流動相。本實驗采用流動相乙腈-0.1%磷酸(14∶86)，實驗證明咖啡酸、阿魏酸對稱性分離度好，理論塔板數(shù)高，達(dá)到實驗的要求。

由于條件有限, 川芎配方顆粒樣品數(shù)量較少, 有待在進一步試驗中積累數(shù)據(jù), 對咖啡酸、阿魏酸含量制訂一個限量范圍, 使其質(zhì)量更加穩(wěn)定可靠。通過本實驗，建立HPLC測定川芎配方顆粒中咖啡酸、阿魏酸含量方法，各項研究符合含量測定方法的要求，可有效控制川芎配方顆粒質(zhì)量，進一步保證臨床療效。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].一部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:26.

[2] 李秋怡,干國平,劉焱文，等.川芎的化學(xué)成分研究及藥理進展[J].時珍國醫(yī)國藥,2006，17(7)：1298-1299.

[3] 北京制藥工業(yè)研究所.川芎成分的化學(xué)研究[J].藥學(xué)通報,1980,15(10):471.

[4] 王文祥,顧明,蔣小崗,等.川芎化學(xué)成分的研究[J].中草藥,2002,33(1): 4-5.

[5] 王義雄,高宣亮,王普善,等.川芎中的另一類活性成分[J].中草藥,1985,16(11):17.

[6] 張寶林, 虎佩蘭, 徐正谷,等.川芍紅花注射液對百日咳菌液所致兔腦水腫的作用[J].中西醫(yī)結(jié)合雜志，1988，8(9)：544.

[7] 劉眾, 史蔭綿, 陳達(dá)仁，等.川芎對急性實驗性腦缺血大白兔血漿和腦脊液中強啡肚A1-13含量的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合雜志,1990,10(3)：380.

(責(zé)任編輯：魏 曉)

Extraction Process and Content Determination of Coffee Acid and FeruLic Acid in Chuanxiong FormuLa Granule

Luo Xu, Hu Changjiang, Wu Wenhui, Wang Hu, Feng Jian

(Neo-GreenPharmaceuticaL Co.Ltd., Chengdu 611930，China)

Objective:Optimization of extraction process of Chuanxiong formula granule, establish Coffee acid and method to determine the content of ferulic acid. Methods:The optimum extraction process of Chuanxiong formula granule by orthogonal test, using HPLC to establish a method for determination of the Coffee acid, ferulic acid. Results:To optimize the extraction process of Chuanxiong formula granule was 10 times the volume of water, soak 0.5h, 1h each time, extracting 3 times; for the determination of Coffee acid and ferulic acid in mobile phase acetonitrile HPLC: -0.1% phosphate (14:86); the detection wavelength: 323nm; flow rate: 1.0mL/min, according to the number of board of ferulic acid peak calculation should not be less than 4 000. Conclusion:The effective components of the extraction efficiency is high, the quality control method is stable and feasible, and can be used as a scientific basis for Chuanxiong formula granule production and quality control.

Chuanxiong Formula Granule；Coffee Acid；Ferulic acid；Content Determination

2014-08-07

羅旭(1980-)，男，四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司技術(shù)員，研究方向為中藥配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

胡昌江(1952-)，男，四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司教授、博士生導(dǎo)師，研究方向為中藥炮制與臨床。E-mail:hhccjj@hotmaiL.com。

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1673-2197(2014)23-0014-03