中國南方地區不育男性Y染色體AZF區域微缺失分析

李 崎，周 繇，馬 寧，盧偉英，徐 雯，馬燕琳

（海南醫學院附屬醫院海南省人類生殖與遺傳重點實驗室，海南 ?？?570102）

中國南方地區不育男性Y染色體AZF區域微缺失分析

李 崎，周 繇，馬 寧，盧偉英，徐 雯，馬燕琳

（海南醫學院附屬醫院海南省人類生殖與遺傳重點實驗室，海南 ?？?570102）

目的 檢測并分析中國南方地區不育男性Y染色體上無精癥因子(Azoospermia factor，AZF)區域的微缺失情況。方法 運用多重PCR技術選用18個STS位點分為四組，設置空白對照，并采用正常男性DNA標本為陽性對照，篩查在海南醫學院附屬醫院生殖醫學中心就診的1 152例診斷為無精、少精及弱精男性的AZFa、AZFb、AZFc和AZFd 4個區域的微缺失情況。結果 1 152例男性患者中共檢出67例AZF微缺失，缺失率為5.8%；其中，無精癥13例，弱精癥1例，少精癥7例，嚴重少精癥46例。上述患者中60例被檢出AZFc合并AZFd區或AZFb合并AZFd區的雙重缺失，1例被檢出AZFc、AZFb合并AZFd區的三重缺失；就各區缺失率而言，AZFa為1.49% (1/67)，AZFb為4.48%(3/67)，AZFc為92.54%(62/67)，AZFd為95.52%(64/67)。結論 采用多重PCR技術進行AZF微缺失檢測十分簡單可行，該項檢測對了解男性不育發生原因、幫助臨床制定輔助生殖技術方案十分必要。

多重PCR；無精癥因子；微缺失

育齡夫婦發生不孕不育的概率為10%～20%，其中約50%由男性因素造成。生精障礙是男性不育的主要原因之一，其受很多因素的影響，如內分泌、營養不良、遺傳因素或環境因素等。1976年，Tiepolo等[1]通過無精癥患者染色體分析發現其Yq11區域內均存在大片段缺失，推測該區域可能存在與精子發生密切相關的基因或基因簇[1]，后續的相關研究陸續證明了這一觀點。目前，人們將這些基因或者基因簇被稱為無精癥因子(Azoospermia factor，AZF)。AZF因子包含4個區域，分別為AZFa、AZFb、AZFc和AZFd區[2-4]。

研究發現，在Y染色體長臂區域包含了眾多的回文結構和插入重復片段，人們推測這種結構是造成AZF區域易發生缺失的可能原因，目前已知，在AZF區域有近300個STS位點標記，這就為檢測AZF區域的缺失提供了極大的便利[5-7]。筆者選用18個STS位點，采用多重PCR技術進行AZF區域的微缺失檢測，以研究中國南方地區男性不育與AZF因子微缺失的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 男性不育患者來自2004-2014年間2 062例來我院遺傳咨詢門診、輔助生育門診就診的患者，經精液常規檢測篩選出1 152例受檢者。無精癥及嚴重少精癥按第四版WHO精液常規分析標準確定，連續3次精液檢查分析并經離心沉淀均無精子者診斷為無精癥，精子密度＜5.0×106/ml者為嚴重少精癥，a+b＜50%或a＜25%為弱精癥。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 抽取受試者外周血3 ml，EDTA抗凝，用紅細胞裂解液裂解紅細胞，分離得到的白細胞用蛋白酶K消化，然后采用笨酚-氯仿法抽提，酒精沉淀提取基因組DNA，-20°C冷凍保存備用。

1.2.2 多重PCR檢測 選用Y染色體上坐落于AZF區內的18個STS位點，分別是AZFa區的SY81、SY182、SY86，AZFb區的SY121、SY124、SY127、SY128、SY130、SY133、SY134，AZFd區的SY145、SY152、SY153，AZFc區的SY242、SY239、SY254、SY255、SY157。設立SRY為內參對照，并同時設立正常男性陽性對照及空白對照，分成四組進行多重PCR擴增(見表1、表2)。各組的反應體系為25μl：含10X緩沖液2.5 μl、dNTPs 0.8 mmol/L、MgCl 21.5 mmol/L、模板100 ng、Taq DNA聚合酶0.5 mmol，引物各10 μmol/L，PCR循環條件設置如下：94°C預變性4 min，30個循環(95°C 30 s、58°C 30 s、72°C 60 s)，72°C延伸7 min，4°C保存。PCR產物用1%瓊脂糖膠電泳120，45 min。EB染色，觀察結果。

表1 引物序列

表2 引物分組

1.2.3 結果判定 若檢測標本中陽性對照及所有位點具有擴增條帶，且陰性對照及空白對照未見擴增條帶，則判斷為無缺失(見圖1)；若待檢標本陰性對照及空白對照未見擴增條帶，SRY內參出現相應條帶，而在多重PCR及單獨擴增時未出現相應條帶，則判斷該位點缺失。

圖1 三對正常父子的18個STS位點電泳圖

2 結果

經臨床及常規精液檢測，在2 026例男性中發現1 152例有精液異常，其中無精癥391例(不明原因)，梗阻性無精癥7例，少弱精癥690例，死精癥6例、單純少精精癥58例。根據精液檢查結果將患者細分為8組，分別命名為A、OA、OⅠ、OⅡ、OⅢ、OⅣ、OⅤ、OⅥ(見表3)。對這1 152例患者進行多重PCR擴增后電泳結果顯示，67例被檢出Y染色體AZF區微缺失，總缺失率為5.8%，4個區的缺失發生率從高到低的排列依次為AZFd(95.52%，64/67)、AZFc(92.54%，62/67)、AZFb (4.48%，3/67)、AZFa(1.49%，1/67)。缺失區域的組合類型分別為AZFa、AZFb、AZFc、AZFd、AZFbd、AZFcd和AZFcbd(見表4)，且AZFcd出現頻率最高，缺失發生頻率最高的STS位點為SY239(91.04%)(見表5)。

將精液檢測結果與AZF缺失檢測結果結合起來分析發現，AZFa區的缺失僅出現在無精癥患者中，AZFb區的缺失分別出現在無精癥和少弱精癥患者中，檢出頻率分別為8.3%(1/12，A組)和5.5%(3/54，含OⅠ、OⅡ和OⅢ組)；AZFc區缺失分別出現在無精癥和少弱精癥患者中，檢出頻率分別為92.3%(12/ 13，A、OA組)和92.5%(50/54，含OⅠ、OⅡ和OⅢ組)；AZFd區缺失分別出現在無精癥和少弱精癥患者中，檢出頻率分別為84.6%(11/13，A、OA組)和96.2% (52/54，含OI、OⅡ和OⅢ組)。

表3 患者依據精液檢測結果分組

表4 各組突變類型統計

表5 STS位點缺失率統計

3 討論

AZF區域位于Y染色體長臂上，這個區域發生的缺失是男性不育發生的已知重要遺傳因素。采用PCR-STS位點檢測微缺失已經成為臨床男性不育檢測的常規內容[8]。

大多數研究者認為AZF包含AZFa、AZFb、AZFc區，也有學者認為在AZFc和AZFb區之間還有一個AZFd區，這個區域與AZFc和AZFb區在序列上存在交疊。由于每個區域包含的生精相關基因的不同，不同區域的缺失會有不同的臨床表現。研究發現，AZFa區的缺失會影響精原干細胞和Sertoli細胞在精曲小管的生成與分布，該區域的缺失與無精癥密切相關；AZFb區的缺失會影響精原干細胞在細胞減數分裂期的發展，AZFc區的缺失會影響精原細胞向精子細胞轉化，會造成精子生成不足；AZFd區由于序列與AZFb和AZFc存在交疊，該區的缺失表現與AZFb和AZFc區的缺失表型相似[9-11]。

在本研究中，基于精液的常規檢測結果將患者分為了8個組，并在其中的5個組檢測出AZF區缺失。在1 152例男性不育的患者中，AZF區缺失檢出率為5.8%，其中，391名A組中檢出了12例缺失患者，缺失檢出率為3.1%；在7例梗阻性無精癥患者中，發現了1例患者攜帶AZF的缺失，提示梗阻性無精癥患者同樣也存在攜帶基因缺陷的可能；在少精癥(OⅠ和OⅡ組)和嚴重少精癥(OⅢ組)患者中的缺失檢出率分別為2.4%和13.1%，值得注意的是，在OⅠ、OⅡ、OⅢ組患者并非單純的少精，同時還表現出不同程度的精子活力減退，而在OⅤ和OⅥ組中，并未檢出AZF區的缺失，精液常規檢測表明，這兩個組的精子活力正常，相關結果提示，AZF區域的基因不僅與精子的發生相關，還可能影響精子的活動力。

本研究還發現，在缺失區域AZFd區的缺失發生率最高，為95.52%，然后依次為AZFc(92.54%)、AZFb(4.48%)和AZFa(1.49%)；STS位點缺失檢出率最高的為SY239(91.04%)，然后依次為SY254 (89.55%)、SY255(89.55%)、SY242(88.06%)、SY242 (88.06%)、SY153(88.06%)，這些位點全部都分布在AZFc和AZFd區，通過序列比對得知，這些位點在Y染色體上都有多個拷貝，拷貝數從2～7不等(表5)，這也許就是缺失率高發的原因之一。

Y染色體微缺失的檢測幫助我們在一個新的層面上了解了男性不育的發病原因，并開始幫助臨床治療。目前越來越多的人已經認識到AZF微缺失給人們的生育帶來的困擾，并開始尋求相應的技術手段幫助這一類患者解決生育方面的問題，提供相關咨詢，我們有理由相信AZF微缺失檢測將會為越來越多的人提供幫助。

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Y chromosome AZF region microdeletions in infertile males in south China.

LI Qi,ZHOU Yao,MA Ning,LU Wei-ying,XU Wen,MA Yan-lin.Hainan Provincial Key Laboratory for Human Reproductive Medicine and Genetic Research,the Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou 570102,Hainan,CHINA

Objective To detect and analyze the microdeletions of Y chromosome Azoospermia factor (AZF)region in infertile males in South China.Methods A total of 1 152 infertile males with azoospermia and oligozoospermia from Reproductive Medicine Center of the Affiliated Hospital of Hainan Medical University were enrolled and tested for microdeletions of AZFa,AZFb,AZFc and AZFd regions in Y chromosome.Eighteen sets of STS primers were selected and divided to four groups for multiplex polymerase chain reaction(PCR)to determine Y-chromosome microdeletions.Blank controls and positive controls(healthy male's DNA)were included in every PCR experiment. Results Among the 1 152 patients,67(5.8%)were found at least one microdeletion in AZF regions,including 13 cases of azoospermia,1 case of asthenozoospermia,7 cases of oligozoospermia and 46 cases of severe oligozoospermia. Sixty patients had deletions in twoAZF regions:AZFc combined withAZFd orAZFb combined withAZFd.One patient had deletions in three AZF regions:AZFc combined with AZFb and AZFd.The rates of deletions were 1.49%(1/67)for AZFa,4.48%(3/67)for AZFb,92.54%(62/67)for AZFc,and 95.52%(64/67)for AZFd.Conclusion Multiplex PCR is a fast,simple and convenient way to analyze Y chromosome microdeletions,which could help us to understand the real cause of male infertility and provide advice for choosingART strategy.

Multiplex PCR;Azoospermia factor;Microdeletion

R698+.2

A

1003—6350（2014）18—2656—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.18.1044

2014-08-13)