腦毒清顆粒對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后IL-6和TNF-α含量的影響*

曲 穎 王 巍 賈維剛△ 王加志

（1.黑龍江省醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154000）

腦毒清顆粒對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后IL-6和TNF-α含量的影響*

曲 穎1王 巍2賈維剛2△王加志3

（1.黑龍江省醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154000）

目的 觀察腦毒清顆粒對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。方法 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組和腦毒清組，采用線栓法（MCAO）制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型，2h后抽取線栓對(duì)大鼠進(jìn)行腦缺血再灌注，研究腦毒清顆粒對(duì)腦缺血再灌注神經(jīng)功能缺損、腦梗死體積、血清中白細(xì)胞介素（IL-6）和腫瘤壞死因子（TNF-α）含量的影響。結(jié)果 腦毒清顆粒能減少M(fèi)CAO神經(jīng)功能缺損評(píng)分和腦梗死體積，降低血中IL-6和TNF-α含量。結(jié)論 腦毒清顆粒對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷有一定保護(hù)作用。

腦毒清顆粒 缺血再灌注損傷 白細(xì)胞介素-6 腫瘤壞死因子-α

隨著缺血性腦損傷機(jī)制研究的不斷深入，腦缺血早期的炎癥反應(yīng)及其損傷日益受到關(guān)注［1］。白細(xì)胞介素6（IL-6）通過多種方式參與缺血再灌注損傷過程。炎性介質(zhì)腫瘤壞死因子α（TNF-α）在腦缺血再灌注損傷中具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)制作腦缺血再損傷模型（MACO），觀察腦毒清顆粒對(duì)IL-6、TNF-α的影響，以研究腦毒清顆粒對(duì)腦缺血灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量（300±20）g，由哈爾濱市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（2011007018）。腦毒清顆粒劑（由黑龍江省中醫(yī)研究院藥劑室提供）；IL-6、TNF-α定量ELISA試劑盒（北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司）；考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒（南京建成生物工程研究所）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。儀器：高速冷凍離心機(jī)（D-37520型，德國(guó)Heraeus公司）；Multiskan MK3型酶標(biāo)儀（芬蘭Thermo Labsystems公司）；輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)（德國(guó)LEICARNZ135）；光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS）；醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)Bl-2000（成都泰盟科技有限公司）；數(shù)顯式電熱恒溫箱（上海躍進(jìn)儀器廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 動(dòng)物分組及給藥方法：將大鼠隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組10只、假手術(shù)組10只、模型組和腦毒清組各30只，模型組和腦毒清組按灌注時(shí)間分為12h、24h、48h 3個(gè)亞組，每組10只，同時(shí)各組在腦缺血再灌注12h時(shí)再行TTC染色觀察腦梗死體積。腦毒清組以60mg/（kg·d）灌胃，模型組和假手術(shù)組給予等量0.9％氯化鈉注射液。連續(xù)給藥7d，末次給藥30min后，對(duì)大鼠進(jìn)行右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞模型手術(shù)。右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞（MACAO）模型制作，參照稍加改良的Longa法［2］。

1.3 觀察指標(biāo) 神經(jīng)功能缺損體征評(píng)分：MACO術(shù)后（大鼠意識(shí)恢復(fù)后30min）對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺陷進(jìn)行評(píng)分。按Longa 5分法進(jìn)行［3］。其中1～3分者納入研究。大鼠腦梗死體積的測(cè)定：10％水合氯醛深麻醉下，快速開胸暴露心臟，經(jīng)升主動(dòng)脈快速灌注37℃肝素化0.9％氯化鈉注射液250mL以移除血液，斷頭取腦，將腦放入-20℃冰箱冷凍10min至腦變硬，從大腦半球額極至枕極用切腦模具連續(xù)冠狀切片6片，每片厚2mm。將腦片小心放入2％TTC磷酸緩沖液中，37℃避光孵育30min，繼續(xù)將腦片置于4％多聚甲醛的0.1mmol/L磷酸緩沖液中避光后固定24h，數(shù)碼相機(jī)拍照。經(jīng)TTC染色后，正常腦組織由于線粒體琥珀酸脫氫酶正常而被染成粉紅色，梗死區(qū)該酶活性喪失而呈蒼白色，界限分明，利用圖像分析軟件分別測(cè)出梗死面積及缺血側(cè)半球面積，梗死體積=梗死面積×厚度。為減小操作誤差及水腫的影響，以相對(duì)梗死面積，即梗死體積占半球體積百分比（V％）表示，V％=梗死體積/缺血半球體積×100％。血漿IL-6、TNF-α的測(cè)定：假手術(shù)組于麻醉前及假手術(shù)后12h眼窩取血。模型組及腦毒清組于MCAO前眼窩取血，術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)斷頭取血。檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10min后離心，分離血漿備用。嚴(yán)格按說明書操作，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血漿中IL-6、TNF-α濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦毒清顆粒對(duì)大鼠神經(jīng)功能的影響 見表1。缺血再灌注術(shù)后，模型組動(dòng)物表現(xiàn)出明顯神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能障礙，而腦毒清組大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀均獲不同程度改善（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 MCAO大鼠術(shù)后神經(jīng)功能評(píng)分（分，±s）

表1 MCAO大鼠術(shù)后神經(jīng)功能評(píng)分（分，±s）

腦毒清組與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別 術(shù)后24 h 術(shù)后48 h模型組 3.65±0.51 3.96±1.38腦毒清組 3.02±0.12△ 2.67±0.67△△n 術(shù)后12 h 10 3.19±0.21 10 3.11±0.02△

2.2 腦毒清顆粒對(duì)大鼠腦梗死體積的影響 見圖1。TTC染色結(jié)果可見，假手術(shù)組經(jīng)TTC染色后腦片全紅，模型組大鼠右側(cè)額頂葉皮質(zhì)及紋狀體可見明顯的白色梗死灶，腦毒清組與模型組比較梗死面積明顯減小。

2.3 腦毒清顆粒對(duì)大鼠血漿IL-6、TNF-α含量的影響 見表2，表3。模型組IL-6、TNF-α含量顯著高于假手術(shù)組（P＜0.01）。腦毒清組與模型組比較，IL-6、 TNF-α含量顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果提示腦毒清顆粒可以減少大鼠炎性因子IL-6、TNF-α的生成，對(duì)炎癥損傷有保護(hù)作用。

圖1 腦毒清組與模型組梗死面積比較

表2 各組大鼠血漿IL-6含量（μg/L，±s）

表2 各組大鼠血漿IL-6含量（μg/L，±s）

與模型組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，△P＜0.01，下同。

組 別 術(shù)后24 h 術(shù)后48 h假手術(shù)組n 10術(shù)前 術(shù)后12 h 143.5±15.8 148.6±16.3模型組 223.6±26.8 186.4±21.7 10 146.7±20.7 236.0±17.5腦毒清組 10 136.9±21.0△199.6±10.6△186.3±13.2△167.4±16.3△

表3 各組大鼠血漿TNF-α含量（μg/L，±s）

表3 各組大鼠血漿TNF-α含量（μg/L，±s）

組 別 術(shù)后24 h 術(shù)后48 h假手術(shù)組n 10術(shù)前 術(shù)后12 h 83.9±13.0 81.7±14.3模型組 142.1±26.7 121.4±15.7 10 84.7±12.9 159.3±15.5腦毒清組 10 82.2±9.7△126.9±11.6△ 114.3±11.2△106.0±14△

3 討論

腦梗死后缺血區(qū)的炎癥反應(yīng)主要表現(xiàn)在白細(xì)胞聚集、溶酶體破壞、水解酶生成、氧自由基產(chǎn)生、炎癥介質(zhì)形成等方面。腦缺血再灌注后內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)使血腦屏障受損，加重了腦損害及腦水腫，此病理生理過程的基礎(chǔ)是以TNF-α、IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子為代表的多種炎性介質(zhì)失控、釋放而形成的“瀑布效應(yīng)”［5］。因此阻斷炎癥反應(yīng)是治療缺血性腦血管疾病的一個(gè)重要策略。IL-6由T細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生，具有廣泛生物學(xué)功能，參與機(jī)體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。目前認(rèn)為IL-6是急性缺血期腦損傷程度的一個(gè)標(biāo)志［6］。TNF-α是與炎癥及免疫反應(yīng)有關(guān)的巨噬細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子。在腦缺血早期TNF-α分泌或合成的增加是腦梗死形成的主要原因［7］，它具有增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，誘導(dǎo)細(xì)胞黏附因子表達(dá)等作用。TNF-α在腦缺血后誘發(fā)的白細(xì)胞浸潤(rùn)和組織損傷中起重要作用，可引起多核白細(xì)胞聚集和激活并釋放炎癥介質(zhì)。因此，通過各種措施阻斷TNF-α的表達(dá)可減少缺血性神經(jīng)元損傷。TNF-α還可激活其他細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，如誘導(dǎo)IL-6的合成等。

本研究發(fā)現(xiàn)，腦毒清顆粒可有效抑制腦缺血再灌注后TNF-α和IL-6含量的增加（P＜0.01），提示上述炎性細(xì)胞因子參與了腦缺血再灌注的損傷過程。腦毒清顆粒抑制了TNF-α、IL-6的表達(dá)，從而抑制再灌注后的炎癥反應(yīng)，縮小缺血再灌注后腦梗死體積，改善神經(jīng)功能缺損評(píng)分。表明腦毒清顆粒對(duì)缺血性神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用。同時(shí)說明應(yīng)用MCAO模型確切可靠。結(jié)合既往研究表明，腦毒清顆粒對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用是多途徑、多靶點(diǎn)的。

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［3］張家良，張小燕.頭針對(duì)急性腦卒中的臨床療效［J］.中國(guó)康復(fù)，2007，22（2）：121-121.

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Effects of Naoduqing Granules on IL-6 and TNF-α Contents in Model Rats with Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury

QU Ying，WANG Wei，JIA Weigang，et al.
Provincial Hospital of Heilongjiang，Heilongjiang，Harbin 150001，China

Objective：To study the protective effects of Naoduqing granules on cerebral ischemia/reperfusion damage.Methods：Rats were randomly divided into control group，sham operation group，model group，and Naoduqing granules group.Animal model of focal cerebral ischemia was established by using suture method in mature SD rats.The neurological severity scores as well as the activity of IL-6 and TNF-α in brain tissue of cerebral ischemia were detected.Results：In compared with the model group，the level of IL-6 and TNF-α were decreased with significant statistical differences in treatment group.Conclusion：Naoduqing granules have obvious ameliorating effect on focal cerebral ischemia in rats，which is caused by reduction of IL-6 and TNF-α contents.

Naoduqing granules；Cerebral ischemia-reperfusion injury；IL-6；TNF-α

R289.9

A

1004-745X（2014）10-1823-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.10.019

2014-05-28）

黑龍江哈爾濱市青年科技創(chuàng)新人才研究專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2010RFQYS084）

△通信作者