CML28與WT1在急性白血病細胞中的表達及相關性

白雪玲，莊紅麗

急性白血病(acute leukemia，AL)是常見的造血干/祖細胞惡性克隆性疾病之一。其發病機制包括以激活信號傳遞為主的基因突變(FLT3、c-KIT、RAS等)，可導致白血病細胞異常增殖，以及影響轉錄因子或輔助活化復合物(C/EBPA、MLL、NPM1等)所致的細胞分化受損等［1］。因此，基因突變或基因表達調節紊亂在AL的發病機制中占據非常重要的地位。目前，國內外對其發病機制進行了深入研究，發現腫瘤抗原分子CML28或WT1高表達于急性白血病細胞中，尤其是急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)細胞中［2］。

近年來，關于CML28分子在白血病表達、微小殘留病(minimal residual disease，MRD)檢測及白血病復發等方面的研究顯示，CML28分子在白血病發病機制中起著關鍵的作用。此外筆者已經做過的相關實驗證實了CML28分子在白血病中的作用，諸如:樹突狀細胞的體外培養，DC免疫應答疫苗的構建，樹突狀細胞負載CML28抗原誘導特異性的CTLs，RNA干擾SOCS1基因表達對DC成熟和功能的影響，以及DC疫苗的增敏作用研究等［3-5］。在靶向治療日益重要的今天，CML28分子有望成為一個很好的基因治療靶點，而WT1分子與其有著相似的表達譜，是公認的檢測MRD的標記分子［6，7］，為此筆者擬通過如下實驗探討CML28分子與WT1分子在白血病細胞中的表達情況及可能的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料 收集華中科技大學附屬同濟醫院2009-01至2009-06收住入院的29例初治AL患者骨髓標本。

1.2 試劑及設備 反轉錄試劑盒購于加拿大的Fermentas公司;Realtime PCR Master Mix(SYBR GREEN)購于日本的TOYOBO公司;Doc Gel 2000凝膠圖像分析系統購于英國的Pharmacia Biotech公司;低溫高速離心機購于德國的Heraus公司;STEPONE-7500 48孔實時定量PCR反應儀購于美國ABI公司(精密度99.7%);PCR反應儀購于美國的ABI公司;Trizol試劑購于陜西Invitrogen公司;Ficoll分離液購于上海GE公司;1×紅細胞裂解液(自配:2M Tris-HCl pH8.2，0.5 ml;4M NaCl 10ml，2 mM EDTA 0.4 ml，加ddH2O至100 ml，高壓滅菌，4℃保存);實驗中所使用引物由上海生工設計并合成。

1.3 方法

1.3.1 骨髓單個核細胞的提取 收集29例臨床初治急性白血病患者骨髓標本，Ficoll分離液及1×紅細胞裂解液獲取骨髓標本中的單個核細胞，按Ficoll分離液說明書操作，細胞計數，取106～107單個核細胞加入1 ml Trizol試劑，-70℃保存備用。

1.3.2 細胞總RNA的提取及第一鏈cDNA的合成Trizol一步法提取細胞總RNA，試劑準備:氯仿、異丙醇、75%乙醇、Free RNase水，按Trizol試劑說明書操作。采用Fermentas反轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA，置于-20℃保存備用。

1.3.3 反轉錄PCR反應及凝膠電泳分析

1.3.3.1 特異性反轉錄PCR引物序列 見表1。

表1 特異性人反轉錄PCR引物序列

1.3.3.2 反轉錄PCR反應 以第一鏈cDNA為模板進行反轉錄PCR反應，反應體系及條件如下:10× Reaction buffer 2.5 μl，DNTPmix(2 mmol/L)2.5μl，Mg2+1.75 μl，cDNA1.0 μl，Taq 酶0.75 μl，上、下游引物(5 pmol/L)各1.0 μl，ddH2O 12.5 μl，總反應體積25.0 μl。三種基因反應條件相同:94℃預變性3 min，94℃變性30 s，59℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環，終末延伸10 min。

1.3.3.3 瓊脂糖凝膠電泳 制備1%瓊脂糖凝膠，上樣電泳后，0.5%EB溶液染色30 min，Doc Gel2000凝膠圖像分析系統分析染色后的瓊脂糖凝膠。

1.3.4 實時定量PCR反應及數據采集

1.3.4.1 特異性實時定量PCR反應引物序列 見表2。

表2 特異性人實時定量PCR引物序列

1.3.4.2 實時定量PCR反應 反應體系及條件按SYBY GREEN Master Mix說明書進行，如下2×SYBY GREEN Master Mix 5 μl，上、下游引物(5 pmol/L)各1 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 2 μl，總反應體積10 μl。三種基因反應條件相同:95℃預變性1 min，95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s(collect data)，共40個反應循環。

1.3.4.3 數據采集 選CML28及 WT1高表達的K562細胞為參照，骨髓標本及K562細胞的內參基因GAPDH的CT值控制在19～21，每樣本設2個復孔，重復2次取平均值。2-ΔΔCT表示試驗組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數，由此得到目的基因CML28、WT1相對于管家基因GAPDH的拷貝數。

1.4 統計學處理 采用SPSS17.0統計學軟件進行統計學分析，分類資料采用SPEARMAN分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 反轉錄PCR反應檢測CML28與WT1在AL患者骨髓細胞中的表達情況 圖像分析結果顯示，在預定的699 bp處可看到CML28清晰明亮的條帶，預定的598 bp處可看到清晰的GAPDH內參條帶，預定的198 bp處可看到清晰的WT1的條帶(圖1、2)。

圖1 AL患者骨髓細胞中CML28的表達

圖2 AL患者骨髓細胞中WT1的表達

2.2 Real time PCR檢測CML28及WT1在AL患者骨髓細胞中的表達情況 由圖3可以明顯看出29例臨床骨髓標本中的CML28和WT1分子的mRNA表達水平的變化趨勢及方向基本上是一致的，擬合度相似。

圖3 CML28與WT1分子在急性白血病骨髓細胞中的表達情況

2.3 相關性分析結果 SPSS17.0軟件分析兩組數據均為非正態分布數據，采用SPEARMAN分析兩組數據間的相關性，有顯著統計學意義，r=0.462，P=0.008，二者有明顯的正相關關系。

3 討 論

CML28分子是由Yang等［3］利用血清篩選重組cDNA表達文庫(SEREX)技術，從異基因造血干細胞移植(HSCT)后復發并經供者淋巴細胞輸注重新達到緩解的慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia，CML)患者的血清中篩選出的一個靶抗原，基因全長為1126 bp，定位于19號染色體長臂1區3帶(19q13);CML28分子具有較強的免疫原性，高表達于各種增殖能力旺盛的實體腫瘤、急性白血病、慢性髓系白血病的急變期以及CD34+的造血前體祖細胞中等［3，8］。

目前，關于白血病發病機制的研究越來越多，其中轉錄后調控紊亂是導致白血病發生的重要機制之一。眾所周知，mRNA水平的基因調節極其復雜，尤其是關于前mRNA的剪接、編輯、輸出、mRNA的定位、翻譯及穩定的研究，以驚人的速率增長著，越來越多的涉及基因表達和調節的蛋白被發現是多功能的，大部分多功能的蛋白質都含有可以結合DNA、RNA以及調節蛋白的C2-H2鋅指結構環，而WT1就是鋅指蛋白的典型代表［9-11］。此外，文獻［12-15］也通過一系列的試驗證實鋅指病毒蛋白(Zinc-finger antiviral protein，ZAP)可以通過其特有的C2-H2鋅指結構環募集人的EXOSOME的核心成分之一hR-rP46P來發揮其相應的生物活性，而研究發現CML28分子與人EXOSOM的核心成分之一hR-rP46P，除了在5'端編碼區多出了33個氨基酸的編碼序列外，二者的核苷酸序列完全相同［3］，說明CML28分子是hRrP46P的類似物，那么筆者推測WT1也可以通過其特有的C2-H2鋅指結構環和hR-rP46P類似物CML28分子協同發揮作用。

WT1在急性白血病中的高表達是首先被Miwa等報道的，研究顯示WT1在ALL、CML、MDS、兒童AML以及正常人CD34+造血前體細胞中呈現高表達［4，7，12-13］。這與CML28分子在白血病中的表達譜是相似的，也和筆者早期及本實驗的結果是比較吻合的，在本實驗中通過RT-PCR及實時定量PCR方法檢測出CML28與WT1在AL患者骨髓中同時高表達，尤其是在急性髓系白血病中表達更高，且二者mRNA表達水平呈現一定的正相關關系，說明二者在AL的發生、發展及預后評估中都扮演著很重要的角色。目前，關于CML28與WT1是否可以作為評價急性白血病療效、判斷預后及預測復發的標記分子均值得期待。

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