人工淚滴眼液無菌檢查方法驗證的探討

宮瑞中王 麗王峻峰張 琳冀 明王 婧鄧自新程愛華

（1 山西省眼科醫院，山西 太原 030002；2 山西省藥檢所，山西 太原 030001）

人工淚滴眼液無菌檢查方法驗證的探討

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（1 山西省眼科醫院，山西 太原 030002；2 山西省藥檢所，山西 太原 030001）

目的 建立我院制劑人工淚滴眼液的無菌檢查法。方法 依據《中國藥典）2010年版二部附錄ⅪH無菌檢查法，分別采用直接接種法、薄膜過濾法對人工淚滴眼液進行無菌檢查方法研究。結果 直接接種法與薄膜過濾法都滿足驗證要求，但因我院制劑人工淚滴眼液為微黏稠澄明液體，薄膜過濾法不易操作，過濾困難，而直接接種法方便操作的同時還可以定量計算污染率。結論 直接接種法可以作為我院制劑人工淚滴眼液進行無菌檢查的首選方法。

人工淚滴眼液；直接接種法；薄膜過濾法；方法驗證

我院制劑人工淚滴眼液用于無淚液患者及干燥性角膜炎、結膜炎，為了確保臨床用藥安全，需對其進行無菌檢查。按照《中國藥典》2010年版二部附錄ⅪH無菌檢查法的要求[1,2]，我們分別采用直接接種法和薄膜過濾法對3批人工淚滴眼液進行了無菌檢查的方法學驗證[3]，結果表明我院制劑人工淚滴眼液采用直接接種法是行之有效的。

1 實驗材料

1.1 儀器

SPX-250B-Z型生化培養箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；MJX-205B-Z型霉菌培養箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；MLS-3780高壓蒸汽滅菌器（三洋電機株式會社）。

1.2 本實驗所用菌株

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、生孢梭菌[CMCC（B）64941]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]（本實驗所用菌株均購自中國食品藥品檢定研究院，均為第三代）。

1.3 培養基及試藥

營養瓊脂培養基（批號12330）、營養肉湯培養基（批號1203122）、硫乙醇酸鹽培養基（批號1304102）、玫瑰紅鈉瓊脂培養基（批號120410）、改良馬丁培養基（批號120515）、改良馬丁瓊脂培養基（批號120113），以上均由中國食品藥品檢定研究院提供。人工淚滴眼液（批號20130603、20130607、20130613由山西省眼科醫院制劑室生產）。

2 方法與結果

驗證環境為10000級潔凈條件下的局部100級單向流空氣區域內進行。實驗環境無菌室及潔凈臺按《醫藥工業潔凈室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標準進行潔凈驗證，測定結果符合規定。

2.1 菌液制備

2.1.1 接種金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養物少許至營養肉湯培養基10 mL中，接種生孢梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中，35 ℃培養24 h，取此培養物1 mL加0.9%的無菌氯化鈉注射液9 mL，10倍遞增稀釋至＜100 cfu/mL的菌懸液，做活菌計數備用。具體見表1。

2.1.2 接種白色念珠菌的新鮮培養物至10 mL改良馬丁培養基中，25 ℃培養48 h，取此培養液1 mL加0.9%的無菌氯化鈉注射液9 mL，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5，使菌數約＜100 cfu/mL。

2.1.3 接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂培養基中，25 ℃培養5 d，加入5 mL的含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%的無菌氯化鈉注射液，將孢子洗脫，吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%的無菌氯化鈉注射液制成每 1mL含孢子數＜100 cfu/mL的孢子懸液。

表1 驗證試驗用活菌計數

2.2 培養基適用性檢查

2.2.1 無菌性檢查

取上述硫乙醇酸鹽流體培養基、改良馬丁培養基（每批培養基隨機抽取不少于5瓶）各制備成滅菌溶液，在相應條件下培養14 d，結果表明為無菌生長。

2.2.2 靈敏度檢查

取裝有12 mL的硫乙醇酸鹽流體培養基的試管9支，分別接種＜100 cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照，32 ℃培養3 d；取5支裝量為9 mL的改良馬丁培養基，分別接種＜100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照，25 ℃培養5 d，逐日觀察結果。結果表明，加菌的培養基管均生長良好，而空白對照管均無菌生長，因此靈敏度檢查符合規定。見表2。

表2 培養基靈敏度試驗

2.3 方法驗證

2.3.1 薄膜過濾法

①陽性組：將制備好的各試驗菌液分別接種至相應的培養基（50毫升/支）中。②試驗組：取15支樣品，過濾于一次性三聯集菌器中，將樣品注入無菌氯化鈉注射液中，過濾，再用無菌氯化鈉注射液沖洗，在最后一次的沖洗液中加入相應的試驗菌液1 mL，沖洗完后，將濾膜取下，接種至相應培養基中。③樣品組：方法同試驗組，但不加相應的試驗菌液。④陰性對照組：另取同批次的一支硫乙醇酸鹽流體培養基和一支改良馬丁培養基作為陰性對照。將上述各組置規定溫度下培養3～5 d，逐日觀察，結果見表3。試驗中發現，同對照組比較，含樣品的各組中的試驗菌均生長良好，并與各陽性對照組中相應的菌落生長情況相似，陰性對照組無菌生長，表明樣品在此檢驗條件下無抑菌作用，但試驗中發現，由于人工淚滴眼液的性狀為無色的微黏稠澄明液體，難以通過濾膜，薄膜過濾法不易操作，影響試驗的順利進行，因此不建議采用薄膜過濾法進行人工淚滴眼液的無菌檢查。

2.3.2 直接接種法

①試驗組：取樣6支，其中4支每支取樣2 mL加至硫乙醇酸鹽流體培養基20 mL中，其余2支每支取樣2 mL加至改良馬丁培養基20 mL中，再分別加入6株試驗菌。②陽性組：另取一裝有同體積相應培養基的試管，加入等量試驗菌，作為陽性組。③樣品組：分別取樣2 mL加至硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基。④陰性對照組：另取同批次的硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基作為陰性對照。將上述各組置規定溫度下培養3～5 d，逐日觀察，結果見表4。

表3 薄膜過濾法驗證試驗各組生長情況

結果表明，供試品各管中的試驗菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，可以按照直接接種法在該檢查條件下進行供試品的無菌檢查。因此直接接種法從檢驗方法到實驗操作上都適合人工淚滴眼液的無菌檢驗。

3 結 論

綜上所述，按照《中國藥典》（2010年版）可采用直接接種法或薄膜過濾法進行人工淚滴眼液的無菌檢查，在兩法的方法驗證中，我院制劑人工淚滴眼液對對照菌均無抑制作用。鑒于人工淚滴眼液為微黏稠的液體，直接接種法與薄膜過濾法更加方便易行、污染概率小，且在方法驗證后的大規模試驗中能定量計算人工淚滴眼液的污染率，更能體現方法的科學性和檢驗結果的準確性，是我院制劑人工淚滴眼液無菌檢查的首選方法。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(二部)附錄103[M].北京:中國醫藥科技出版社,2010.

[2] 趙亞麗,吳英.雙黃連注射液無菌檢查的方法驗證[J].黑龍江醫藥,2011,24(1):31-33.

[3] 李彩霞.參芪注射液無菌檢查的方法驗證[J].海峽藥學,2010, 22(6): 35-36.

R446

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1671-8194（2014）18-0089-02